アタカマ化石デルタ地帯の暗い微生物叢と極度に少ない有機物が火星生命の検出限界を明らかにする

Nature Communications volume 14、記事番号: 808 (2023) この記事を引用

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火星における生命の明確な兆候を特定することは、火星にミッションを送るための最も重要な目的の 1 つです。今回我々は、アタカマ砂漠の乾燥条件下で形成された163～100Myの扇状地と扇状地デルタ地帯であるレッドストーンについて報告する。レッドストーンは赤鉄鉱と、バーミキュライトやスメクタイトなどの粘土を含む泥岩が豊富で、したがって地質学的には火星に類似している。我々は、レッドストーンのサンプルには、異常に高い系統不確実性、我々が「ダークマイクロバイオーム」と呼ぶもの、および状態検査ではかろうじて検出できる現存微生物と古代微生物のバイオシグネチャーの混合物を有する重要な数の微生物が含まれていることを示した。 -最先端の実験装置。火星上にある、または火星に送られるテストベッド機器による私たちの分析により、レッドストーンの鉱物学的性質は、火星の地上の機器によって検出されたものと一致するものの、同様に低レベルの有機物は、不可能ではないにしても検出が困難であることが明らかになりました。火星の石は使用する楽器や技術によって異なります。私たちの結果は、火星に生命が存在したかどうかを決定的に解明するために、サンプルを地球に持ち帰ることの重要性を強調しています。

火星への過去、現在、そして将来のミッションは、主に、火星にかつて生命が存在したのかどうかという未解決の疑問によって動機付けられています1。火星探査車、フェニックス、そして現在活動中の火星科学研究所 (MSL) や Mars2020 探査車などの着陸ミッションは、居住可能な環境を特定し、私たちが知っている生命の必要条件の証拠があるかどうかを任務としていました 2,3。液体の水は主要な要件の 1 つであるため、多くの探査車は、古代の川や湖の地形学的証拠、および/または粘土鉱物などの液体水の鉱物学的証拠のある場所に着陸しました4、5、6。これらの宇宙船には、鉱物を識別し、生命に必要な原料分子を探すためのさまざまな組成機器が装備されています。たとえば、バイキング、フェニックス、MSL、マーズ 2020、および将来の探査車エクソマーズに搭載されている質量分析計は、有機分子や生命の構成要素を検出できます7、8、9、10。バイキングやフェニックスの測定では、火星の土壌中の有機物に関する確実な証拠は見つかりませんでしたが 11,12、MSL の火星サンプル分析 (SAM) 機器スイートと、有機物および化学物質のためのラマンおよび発光による居住可能環境のスキャン (SHERLOC) 機器の両方が、 Mars2020 は、単純な脂肪族有機分子と芳香族有機分子を特定しました (つまり、ゲイルクレーターのイエローナイフ湾泥岩中に約 450 ppm)。

これまでの火星の結果は、その表面には有機物が蔓延していないことを示唆しているが、ここでは、現在の機器の限界15と火星の岩石中の有機物の性質も、赤い惑星で生命の証拠を見つける能力を妨げる可能性があると仮説を立てている。この研究では、地球上で最も乾燥した 16,17,18 最も古い砂漠 19,20,21,22,23,24 と有名な火星であるアタカマ砂漠に位置するユニークな場所であるレッドストーンを綿密に検査することにより、これらの限界をテストします。アナログモデル22。

レッドストーンは、アントファガスタ市の南、ケブラーダデルボク (ボク渓谷) (図 1A、B、図 2) に位置します。上層ウェイグループの一部であり、白亜紀前期からジュラ紀後期に遡るコロソ層とロンブリッツ層（図 1C および図 2B）25。 Way グループは、盆地進化の 2 つの異なる段階を表しており、後方の進行的な海洋侵入とデルタ堆積に至る、近位から遠位のデルタの完全な連続を記録しています。ロンブリッツ層の底部には、多数の垂直脈脈と硬化した岩塩地殻を伴う、挿入された赤い砂岩と泥岩が見られます (図 1D、E、および図 3)。セクションを上に進むと、硬化した礫岩、挿入された砂岩と泥岩のユニットがあり、その上に風化した緩い礫岩が置かれています (図 1E および図 3)。

アタカマ砂漠のレッドストーンの場所 (デジタル地形モデル 86)。 B 周囲の領域を拡大した衛星画像 (Sentinel 2020 衛星データ)。 C カレタ・コロソ・エル・ウェイ形成の報告された堆積記録による、B に示す沖積/デルタ系の古地理的復元 (Flint, S. Clemmey, H. & Turner, P. 北部の白亜紀下層ウェイ・グループから改変)チリ: 扇状地と扇状地のデルタ複合体堆積物. Geology 46, 1-22 (1986)25,87)。 C の黒い矢印は古代の川デルタの流れの方向を示しており、その起源点は現在太平洋の下にあります。 A、B、C の赤い点は、E に示されている露頭の位置を示します。D パネル E に示されている、調査された露頭の層序柱。赤い矢印はサンプル収集ポイントを示します。 E 研究した露頭の拡大図。上から下へ: UZ 上部ゾーン、U1 ユニット 1、WI 壁内センサー位置、U2 ユニット 2、WO 壁外センサー位置、LZ 下部ゾーン。

視察現場の全景です。 B カレタ・コロソ-エル・ウェイ地層の地質図 (SERNAGEOMIN、2003。チリの地質地図: デジタル版 88)。 JK1c (ライトグリーン); 遷移沖積、河川および風成堆積シーケンス。白亜紀前期からジュラ紀後期（砂岩、石灰岩、紅玉岩、礫岩、シルト岩）。 Ki1m (緑); 沿岸海洋堆積物シーケンス。白亜紀前期（砂岩、石灰岩、ローム、カルカレナイト）。 M1c (ライトブラウン); 扇状地の堆積シーケンス。中新世 (砂、砂利、シルト、発火岩)。 J3i (ライトパープル); 火山大陸および海洋ジュラ紀のシーケンス（玄武岩、安山岩、凝灰岩、石灰岩）。

上部の風化した緩い複合体。 B セメンテッド複合体。 C、D 砂岩 (s) と細かい層状の泥岩 (m) を示します。白い矢印は岩塩/石膏の静脈を指します。 E 蒸発鉱脈の 1 つが破壊され、内部の岩塩/石膏とそれを覆うヘマタイトの薄い層が露出しています。 F 露頭の表面に平行な繊維状の岩塩地殻。露出後にのみ観察可能。

レッドストーン堆積相の二次鉱物集合体は古代火星との類似点を示しており、類似の続成史を示唆している。砂岩は、石英と斜長石に加えて、ゼオライト（方解石）、方解石、石膏、岩塩、緑泥石、バーミキュライト、イライト/白雲母、赤鉄鉱で構成されています（図S1A）。ヘマタイトは、火星の水の酸化的変質のマーカーであり、よく発達した結晶と薄い鉱物コーティングとしてレッドストーンに存在し（図S1B、C）、このサイトに特徴的な赤い色を与えています（図2A））。上部の砂岩相をセメントで固めている岩塩に加えて、レッドストーンの砂岩相と泥岩相の下部に横切る白い脈と地殻である岩塩と石膏の存在は、砂岩の堆積中の乾燥条件を裏付けています（図1D、E、図3）。このデルタの堆積物（岩塩と石膏は、軌道上およびその場での古代火星の表面で確認されています30、31、32、33）。層状珪酸塩は古代火星の表面に豊富に存在し、スメクタイトと緑泥石が大半を占めています 34。同様に、レッドストーン泥岩には、イライトとバーミキュライトに加えて、スメクタイト（サポナイトとモンモリロナイト）と緑泥石が含まれています（図S1Aと図S1D）。亜塩素酸塩の存在は、MSL によって調査されたゲイルクレーターの堆積岩が経験する温度と同様の、低温 (70 ～ 90 °C) 続成条件 35 を示唆しています 36。異なる相対湿度 (RH) での X 線回折 (XRD) パターンは、亜塩素酸塩のピーク位置が層間距離の広がりによりわずかに移動することを示しており、環境の変化に応じて亜塩素酸塩が少量の水蒸気を吸収している可能性があることを示唆しています。相対湿度（RH）（図S2）、火星上のこのタイプの粘土の潜在的な居住可能性を検査するための興味深い発見。アナルシムセメントは、報告されている自生粘土、方解石、石英 37 とともに、閉じた盆地で蒸発する塩水の典型であり、約 30 ～ 40 億年前に火星の衝突盆地に形成された湖に似ています 38。 A-CN-K [Al2O3-(CaO + Na2O) – K2O] 分析 39,40 (図 S3A)、ACN [Al2O3-(CaO + Na2O)] および A-CNK-FM [Al2O3 – ( CaO + Na2O + K2O) – (FeOT + MgO)]地球化学分析（図S3B、C）も続成作用を示しており、一部のサンプルにおけるACNの変化は、熱水作用などの他のプロセスが作用していることも示唆しています。

現場の二重温度/相対湿度ロガーは、上部のより露出した緩い複合体が最も高いRH値を示し(図S4)、夜間および早朝に最大85.1%を示し、この地域で定期的に霧にさらされているのと一致することを示しました。微生物の生活のための主な水源として。

レッドストーンサンプルには土壌 1 グラムあたり最大 1 μg の DNA が含まれており、16 S rRNA 次世代シーケンシング（NGS）分析では、種の数が最も多いのはアルファプロテオバクテリアと放線菌であることが示されました（図 4A および表 S1）。運用分類単位 (OTU) の多様性が最も高いのは、最上部の風化した複合体で見つかりました (図 4B)。これは水の利用可能性が最も高いことと一致しています。最高のRH値とNGS微生物の多様性の間の相関関係により、最上部の集合体で多数のOTUが確認され（図S5A）、また、これらの役割に沿って、蒸発物が位置するゾーンでわずかに多くのOTUの数が明らかになりましたミネラルは、RH の変化に応じて水蒸気を吸収し、微生物の生活に水源を提供します。上部ゾーンのOTUは、日中に最高の表面温度が記録されるゾーンでも見つかり（図S4および図S5B）、そのような種が少なくとも耐熱性であることを示唆しています。

NGS によって決定された主要な細菌門のヒートマップ。数字は総配列のパーセンテージを表します。各ボックス内の色の濃さは、各門の相対的なパーセンテージを示します。 B 分析された原核生物群集の豊富さ (S、バー) およびシャノン多様性 (H'、点) 指数。 C NGS によって発見された細菌配列の階層分類。グレースケールの色は、より高い階層の分類を識別します。

NGS 16 S rRNA 配列のかなりの部分は「未分類」のカテゴリー (8.9%) に分類されましたが (図 4A)、残りの配列の 40.8% は目やドメインなどの高次の分類群を超えて割り当てられませんでした (図 4A)。 4C)、したがって、異常に高度な系統的不確定性が明らかになりました。「微生物ダークマター」の概念は、培養代表のない既知の門および候補門からの特徴づけられていない微生物で構成される微生物多様性のまだ解明されていない部分を指すものとして最近提案されている42、43、44。ここでは代わりに、直接 DNA シークエンシング (レッドストーンサンプルの場合と同様) などのハイスループットな方法で検出できるが、系統学的同一性をまだ確認できない微生物群集を指す「ダークマイクロバイオーム」という新しい概念を提案します。決定した。したがって、レッドストーンの暗黒マイクロバイオームは、地球上の他のどこにも見られない真に新しい現存種によって構成されている可能性がありますが、そのような暗黒マイクロバイオームが実際には、かつてレッドストーンデルタに生息していた微生物種の遺存群落を表している可能性もあります。遠い過去のことですが、既存の配列データベースには現存する親戚は見つかりません。

培養依存アプローチにより、レッドストーンサンプルのセット全体から 19 個の固有の細菌と 2 個の真菌分離株のみを取得できました (図 S6)。コロニー形成単位 (CFU) の数は非常に低かった (1.1 × 101 – 9.0)。 × 101、表 S2)、および従属栄養細菌の桿菌科に属するほとんどすべての細菌種が、NGS の所見と一致しています。これらの種の大部分は、それらが分離された場所のサンプルの鉱物学的特徴と独自に一致しており（つまり、ハロバチルス属は蒸発石サンプルで見つかった）、したがって、それらの生態学的好みを反映しています。この場所から分離されたすべての細菌は風成塵を利用してアタカマ川を移動することが知られており 45、レッドストーンがある沿岸地域が内陸で見られる多くの細菌の主な起源地であることを示唆しています。

元素分析により、このユニークな微生物の集合体に由来する全有機炭素 (TOC) 含有量が非常に低く、乾燥重量で最大 0.11% であり、窒素は検出されないことが明らかになりました (表 1)。ガスクロマトグラフィー質量分析 (GC-MS) により、この TOC の脂質画分は主に炭化水素と脂肪酸で構成されていることが示されました (図 5A)。安定炭素同位体分析では、δ13C 値が -19.5 ～ -26.5 パーセントであることが示され (図 5B)、蒸発石サンプルが最も濃縮され、TOC が最も高くなりました。ステロールなどの真核生物の膜に特徴的な脂質は、GC-MS では検出できませんでした。酸鎖の最後から 2 番目の位置にメチル基を持つ脂肪酸 (つまり、iso-17:0) の存在は、硫酸塩還元細菌がかなりの部分を占めている可能性がある細菌の流入を示唆しています 46。他のサンプルと比較して蒸発物で観察された 13C の濃縮は、一価不飽和脂肪酸、イソプレノイド (プリスタンおよびフィタン)、ヘプタデセン、および多くの中鎖モノメチルアルカンの検出とともに、シアノバクテリアのような光栄養生物に起源があることを示唆しています 47,48,49 。しかし、NGS、顕微鏡分析（明視野およびクロロフィル自家蛍光）、培養ではそのような種は検出されなかったため、これらのバイオシグネチャーは実際、レッドストーン扇状地が石化する前に生息していた暗黒微生物叢の光栄養性メンバーの古代の遺跡を表している可能性があります。。この仮説は泥岩サンプルの分析とも一貫しており、C27 から C31 炭素までの一連のホパンの存在も明らかになりました (図 5A)。ホパネスは、主に細菌によって生成されるイソプレノイドファミリーのステロイド様脂質であるホパノイドの最も難解な分子化石であり50、これもレッドストーンデルタの古代住民の潜在的な生体特徴である。

A ガスクロマトグラフィー質量分析法 (GC-MS) によって特定される直鎖 (直鎖) アルカン、直鎖脂肪酸、一価不飽和脂肪酸 (MUFA) などの脂質含有量。炭素数の範囲は括弧内に示されています。 B 総有機炭素 (TOC、% dw) および安定炭素同位体組成 (δ13C、‰) の値が求められます。 C、D、Eはラマン分光法で分析したサンプルを示し、一方(F)は非晶質シリカを豊富に含む基板上に脂質を沈着させたポジティブコントロールを示す(パネルFはCarrizoらの許可を得て改変した89)。

n-アルカンの合計に対する n-脂肪酸の合計の比率は、特定の環境におけるバイオマスの鮮度の尺度を提供する可能性があります。カルボキシルなどの酸素官能基は時間の経過とともに分解する傾向があり、より耐性のある炭化水素（つまり、アルカン）が蓄積するため、n-脂肪酸/n-アルカン比が比較的高いことは、より新鮮なバイオマスの兆候と解釈できます51。層序と蒸発物の上部からのサンプルは最も高い比率を示し（≧16、表1）、これらのサンプルにはより新鮮な/より新しいバイオマスが含まれていることを示唆しており、NGSによって決定された最も高い微生物多様性と、最も高い水の利用可能性と一致しています。これらのサンプル。

Mars 2020探査車のSuperCam機器スイートのラマンと同様の532 nm源を使用したラマン分光法では、XRDによって検出された鉱物の存在が確認されました（図S7）が、脂質の兆候は見つかりませんでした（図5C〜F）。、濃度が極めて低い場合のさまざまな種類の有機物の検出における、レーザー光源やスポットサイズなどのラマンパラメーターの重要な適切な選択を明らかにします。

SYBR Green DNA 染色は、下部ゾーンの単一サンプルで成功し、いくつかの球状細胞と桿菌細胞が明らかになりました (図 S8)。ただし、触媒によるレポーター沈着-蛍光 in situ ハイブリダイゼーション (CARD-FISH) では、すべてのサンプルで極めて低レベルの細菌および古細菌 (図 S9、S10) を検出でき、最高数 (1 グラムあたりわずか 6 × 105 細胞) でした。これも、これらのサンプルが最も高い生物多様性と水の利用可能性を持っていることと一致しています。

レッドストーンサンプルを最初に特徴付けるために使用されたいくつかの技術が検出限界で生命の証拠を示したことを考えると、火星に送られる一連のテストベッド機器がレッドストーンサンプルから何を検出するかを検査することは興味深いことでした。現在および将来のミッションでは、特に同様の粘土が豊富な扇状地/扇状地デルタを調査しています52,53。

DRIFTS（拡散反射赤外フーリエ変換分光法）、RLS（ラマンレーザー分光計ExoMarsシミュレーター）、LIBS（探査機キュリオシティおよびパーサヴィアランスに搭載されたレーザー誘起破壊分光法）などの技術は、サイトの鉱物組成と厳密に一致しました（図S11- S13、表 S3、表 S4)、有機物の検出ははるかに困難であることが判明しました。

鉱物格子の振動によるより強いバンドが有機物の潜在的なバンドを覆い隠したため、NIR領域では有機物のDRIFTS検出はかろうじて可能でした（図S11A）。レッドストーンサンプルスペクトルの 1.36 μm の単一ピークのみが、有機物の非基本バンドによって説明できました。対照的に、有機物に起因する多くの（非常に弱いですが）バンドが中赤外（MIR）スペクトル領域で観察されました（図S11B;表S5の割り当て）。

レッドストーンサンプルの SAM 様熱分解 54 により、芳香族化合物、酸素含有芳香族化合物、クロロ芳香族化合物、硫黄含有芳香族化合物など、多数の異なる有機物が検出されました（図 S14）。 UZ、U1、U2サンプル中のC12〜C35直鎖アルカンなどの特定の有機物は、他の有機物と比較して相対存在量が低く検出され（図S14）、C10〜C40アルカンを使用した質量スペクトルと保持時間によって同定されました。標準。アルカンが使用された商用機器の検出限界で検出されたという事実は、ここで使用された商用バージョンと比較して検出限界が約 10 倍低い SAM フライトモデル (~ppbv) を使用してアルカンを検出できない可能性があることを示しています。。ただし、MTBSTFA-DMF を使用した SAM のような誘導体化湿式化学実験 (方法を参照) では、すべてのサンプルで極性分子と誘導体化された C7 ～ C20 n-カルボン酸が同定され、検出された唯一のアミノ酸としてプロリンが明らかになりました (トップ複合体サンプルのみ、図.S15)、この特定のサンプルにおける細菌の活発な代謝と一致します。ジカルボン酸と不飽和脂肪酸の検出は、C16 および C18 脂肪酸とプロリンの発見とともに、これらの有機物が火星の SAM 装置によって検出されることを示唆しています。ただし、これは、これらの分子が豊富に存在し、機器 (カラム、トラップ、トランスファーラインなど) の温度制約、時間など、検出に追加の役割を果たす可能性のある機器変数の影響を受ける場合にのみ可能です。飛行解析の限界、トラップの脱着能力など。

レッドストーンサンプルをMOMA55（ロザリンド・フランクリンExoMars探査車に搭載された火星有機分子分析装置）テストベッド機器でフラッシュ熱分解によって分析したところ、有機物は検出されませんでした（図S16）。ただし、これらのサンプルを MTBSTFA-DMF で誘導体化すると (誘導体化前の直接誘導体化と抽出)、いくつかのピークが同定されましたが、それは蒸発サンプルのみでした。不安定な基-OHのシリル化を通じて誘導体化された脂肪族カルボン酸種（図S17）。これらの結果は、ほとんどのレッドストーンサンプルに MOMA 検出限界以下の有機レベルが含まれていることを明らかにしただけでなく、次世代の飛行計器を検証する上でレッドストーンなどのアナログフィールドサンプルが非常に重要であることも明らかにしました。

レッドストーンのサンプルは、多重蛍光サンドイッチイムノアッセイである LDChip (Life Detector Chip) を使用して他の惑星の分子バイオシグネチャーを検索するように設計された TRL5 機器である SOLID-LDChip、Signs of Life Detector 56,57,58 でも分析されました。他のテストベッド分析と同様に、SOLID 検出はレッドストーンサンプルの検出限界をわずかに超えていましたが（図 S18）、それでも従属栄養細菌と興味深いことにシアノバクテリアの証拠が見つかり、他の技術を使用した現存および遺存微生物に由来する他のバイオシグネチャーと一致しています。。 SOLID によるシアノバクテリアの古代の残存物の検出は、数百万年前にはレッドストーン川デルタ地帯に光合成をサポートするのに十分な水があったことを裏付けるもので、特に興味深いものですが、アタカマが時間の経過とともに乾燥してきたため、もうその水は存在しませんでした（アタカマの場合と同様）火星）。

全体として、レッドストーンは、地質学的および微生物学的特徴のユニークなコレクションを提供し、火星のアナログ設定の乾燥条件下で形成された古代扇状地/扇状地デルタの形成と現存および過去の居住可能性を研究するための優れたアナログモデルサイトを提供します59。この技術は常にすべての種類の有機物を識別できるわけではなかったにもかかわらず、探査機テストベッドを使用したレッドストーンサンプルの分析により、質量分析計での有機物の検出に対する湿式化学誘導体化実験の関連性が明らかになりました。さらに、SOLIDイムノアッセイアプローチは、微生物の構成要素だけでなく、微生物の生命の証拠を検出するための有望な技術であることが示されましたが、レッドストーンよりも低い濃度で存在する火星の微生物はまだ検出できない可能性があります。レッドストーンのサンプルに含まれる固有の現存および絶滅した微生物の多数のバイオシグネチャーが、探査機のテストベッド機器によって限定的または検出されないことは、火星サンプルリターンミッションの極めて重要性を強調しているため、実験室でサンプルの生命の兆候を徹底的に研究できるようになります。 Earth60上で。

レッドストーン露頭の主な現場認識とサンプリングは 2019 年 8 月に行われましたが、その後の現場サンプリングも 2021 年 2 月、5 月、8 月、10 月に行われました。周囲を調査した後、最も継続的な露出が選択され、層序記録の最良のセクションの横断。風化の影響を受けず、地球化学分析に必要な量をサンプリングするのに十分な量の材料を収集する前後に、参考写真とクローズアップ写真を撮影しました。サンプリングは、野外観察とその深さを層面に対してできるだけ垂直に巻き尺で記録し、バイオシグネチャー分析用に適切なラベルを付けてジッパー袋とアルミ箔の蓋付きのガラス管に保管しました。一部の壊れやすい地層（コーティングと塩の層）は、後で研究室で適切に観察および分析できるように、ファルコンチューブに追加で保管されました。層序に沿ったさまざまな地平線を代表する 17 個のサンプルを採取しました (一部は、前述のように後で追加のサンプリングが必要でした)。これは、Strator v5 (Golden Software) を使用してグラフィック対数プロットの形式で表されました。

バルクサンプルの粉末 X 線回折は、Cu Kα 放射線と Lynxeye XE-T 線形検出器を備えた Bruker D8 Eco Advance を使用して実行されました。サンプルは、0.05° (2θ) のステップサイズと 1 秒のカウント時間を使用して、5° (2θ) と 60° (2θ) の間でスキャンされました。相の同定は、測定された回折パターンを DIFFRAC.EVA ソフトウェア (Bruker AXS) を使用して PDF データベースのパターンと比較することによって実行されました。その後、ストークスの法則に従ってデカンテーションにより粘土画分を得た。粘土の測定には、空気乾燥、エチレングリコールによる溶媒和、および 350 および 500 °C で 2 時間の加熱という処理が含まれます。次に、サンプルは、2 ～ 30°(2θ) の範囲にわたって 0.02°(2θ) ステップサイズで、各ステップで 1 秒の収集時間でスキャンされました。

岩石サンプルの配向試験片は、独立行政法人物質・材料研究機構の湿度制御装置を備えたXRD (Ultima IV) によって分析されました。測定は、40 kV および 30 mA の単色 CuKα 放射線を使用して行われました。配向した試験片は、測定前に真空オーブンで 100 °C で 15 時間乾燥させました。乾燥した標本をサンプルチャンバーに置きました。サンプルの XRD パターンは 1% ～ 60% の相対湿度下で測定されました。

風化傾向をグラフで調べるために、化学変化の比例をグラフで解釈できる、最も広く使用されている三元図をいくつか組み込みました。 Grapher v13 (Golden Software) を使用してプロットされた、A-CN-K、ACN、および A-CNK-FM の三元図。

温度と相対湿度は、以前と同様にデュアル iButton 温度/湿度マイクロロガー (Maxim Integrated、米国カリフォルニア州サンノゼ) を使用して現場で測定され 18,23、2 か月間 15 分ごとにデータを取得するように設定されました。

レッドストーンのサンプルは室温で保管され、実験室で直接計数されて数えられました。ミネラルが従来の色素を吸着して細胞をマスクすると細胞の視覚化の効率が低下するため、DAPI (4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩) の代わりに SYBR Green I (Molecular Probes、ユージーン、米国) を使用しました。簡単に説明すると、各サンプル 2 g を 10 mL の 0.01 M ピロリン酸四ナトリウムに懸濁し、Branson 超音波洗浄機 (米国ダンベリー) で氷冷水中で 30 分間穏やかに超音波処理しました。 10 秒間の沈降後、2 mL の上清を採取し、黒色の Isopore ポリカーボネート膜フィルター (孔径 0.2 μm、Millipore、マサチューセッツ州、米国) 上に直接置きました。次いで、膜を１．５ｍＬのＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ（５０μｇ／Ｌ）とともに暗所で１５分間インキュベートした。次いで、膜を１０ｍＬの蒸留水で洗浄し、風乾するために暗所に放置した。液浸油を 1 滴、スライドガラス上に滴下し、次にフィルターに滴下し、さらに 1 滴の油をフィルター表面に滴下し、ガラスカバーで覆いました。 Zeiss AxioImager M.2 蛍光顕微鏡 (Carl Zeiss、イエナ、ドイツ) および Plan-Apo 63x ⁄ 1.4 Zeiss 油浸対物レンズを使用して、細菌を直ちに計数しました。 SBI 染色細菌の可視化には、eGFP 用フィルターセット (Zeiss Filter Set 38; 励起 ⁄ 発光: 450 ～ 490 ⁄ 500 ～ 550 nm) を使用しました。ランダムな視野を選択することによって細菌を計数し、フィルターごとに 20 の視野を分析しました。サンプルごとに 5 つのフィルターがカウントされ、合計 10 個のフィルターと 200 のフィールドが観察されました。

触媒化レポーター沈着蛍光 in situ ハイブリダイゼーション (CARD-FISH) 用のサンプルを PBS 中の 4% ホルムアルデヒドで固定し、さらなる分析まで 4℃ で保存しました。参考文献に記載されているように、超音波処理によって微生物を鉱物粒子から分離し、無菌条件で0.22 mmの黒色膜(Millipore、ドイツ)で濾過した。 61. CARD-FISH 実験、対比染色、およびそれぞれの自己蛍光および非特異的結合コントロールを、以前に詳細に説明したように実施しました 62。 CARD-FISH は、EUB338 I-III ミックスプローブ 63、64 および ARC91565 を使用して実現されました。さらに、追加のハイブリダイゼーション制御として、NON33866 を使用した CARD-FISH が実現されました。すでに報告されているように、サンプルは視覚化および画像化されました61。

Red Stone サンプルは室温で保存され、製造元の指示に従い、以前に実行されたとおり、DNeasy PowerSoil Pro Kit (Quiagen、デュッセルドルフ、ドイツ) を使用して研究室で DNA が抽出されました 18、23、41。

DNA濃度はPicogreenによって定量化されました。次に、以下の存在下で、Q5® Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs) を使用した最初の PCR で、DNA の可変インプットおよび可変サイクル数を使用しました。

16 S 増幅用 100 nM プライマー (5'-ACACTGACGACATGGTTCTACACCTACGGGNGGCWGCAG-3' および 5'-TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTGACTACHVGGGTATCTAATCC-3'、これらのプライマーは 16 S の V3-V4 領域を増幅します)、18 S 増幅用 200 nM プライマー (5'-ACACTGACGACATGGTT CTACAGCCAGCAVCYGCGGTAAY- 3' および 5'-TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTCCGTCAATTHCTTYAART-3')、古細菌増幅用 200 nM プライマー (5'-ACACTGACGACATGGTTCTACACGGRAAACTGGGGATAAT-3' および 5'-TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTTRTTACCGCGGCGGCTGBCA-3')、ITS の場合は 200 nM プライマー (5') -ACACTGACGACATGGTTCTACATCCTCCGCTTATTGATATGC- 3' および 5'-TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTGTGAATCATCGAATCTTTGAA-3') およびシアノバクテリア用の 200 nM プライマー (フォワードとして 5'-ACACTGACGACATGGTTCTACAGGGGAATYTTCCGCAATGGG-3'、および 5'-TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTGACTACTGGGGTATCTAATCCCATT-3' または 5'-TACGGTAGCAGA) GACTTGGTCTGACTACAGGGTATCTAATCCCTTT-3' (リバースとして)。最初の PCR の後、400 nM のプライマー (5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTGACGACATGGTTCTACA-3' および 5'- Illumina シーケンサー (Fluidigm) 用の Access Array Barcode Library の CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-[10 ヌクレオチドバーコード]-TACGGTAGCAGAGACTTGGTCT-3')。

最終的に得られたアンプリコンはバイオアナライザーで検証および定量され、等分子プールはアガローサゲル電気泳動で精製され、「Kapa-SYBR FAST qPCR kit for LightCycle480」と定量用参照標準を使用した定量的PCRで滴定されました。アンプリコンのプールは、10pMの密度でフローセルに播種される前に変性され、そこでクラスターが形成され、「MiSeq試薬キットv3」を使用して、MiSeqシーケンサーでの2×300ペアエンドシーケンシングの実行でシーケンスされました。ここで、古細菌または真核生物の配列（いくつかのよく知られた真菌汚染物質を除く）が見つからなかったことに注意してください。したがって、メインレポートには 16 S データのみが示されています。すべての生の配列データは、アクセッション番号 PRJNA908755 で NCBI Sequence Read Archive (SRA、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) に寄託されました。

生の配列は、69、70、71、72、73 以前に使用されていた MiSeq SOP68 に基づくカスタムスクリプトを使用して、MOTHUR ソフトウェア v.1.43.067 で処理されました。微生物の OTU 豊富さ (S) とシャノン多様性指数 (H') は、「vegan」パッケージ v.2.5-674 を使用して、統計計算用の R 言語 (R Core Team、2019) で計算されました。細菌群集の構成をより良く視覚化するために、STAMP ソフトウェア v.2.1.375 を使用してヒートマップを構築しました。

研究室では、サンプルを室温で保存し、寒天と Luria-Bertani ブロス (Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州)、Marine Media、または改変 Czapek Dox 増殖培地 (CondaLab、Torrejón de Ardoz、スペイン）。これは、土壌サンプルあたり合計 100 mg を、前述の培地を含むペトリ皿に直接振りかけ、これらのプレートを 25 °C でインキュベートすることによって行われました。ほとんどの場合、土壌粒子から生じたコロニーは接種後 2 週間で明らかでした。その後、すべてのコロニーを最初に単離したときの培地で再培養し、その後の DNA 抽出と保存に十分なバイオマスを取得しました。

サンプルは室温で保存され、メーカーの指示に従い、以前に実行されたように、研究室で DNeasy UltraClean Microbial Kit (Quiagen、デュッセルドルフ、ドイツ) を使用してサンプルから DNA を抽出しました 18、21、41。

以前に実施したように、細菌分離株の 18、21、41、16 S rRNA 遺伝子を、GoTaq Green Master Mix (Promega、ウィスコンシン州、米国) とプライマー 341 f (5'CCT ACG GGNGGC WGC AG3') および 785r を使用して研究室で増幅しました。 (5'GAC TAC HVGGG TAT CTA ATC C')。使用したPCR条件は、95℃で5分間、および(95℃で40秒間、55℃で2分間、72℃で1分間)を25サイクル、続いて72℃で7分間であった。真菌分離株の 18 S rRNA は、GoTaq Green Master Mix (Promega、ウィスコンシン州、米国) とプライマー F566 (5'CAG CAG CCG CGG TAA TTCC3') および R1200 (5'CCC GTG TTG AGT CAA ATT) を使用して研究室で増幅されました。 AAG C3')。使用した PCR 条件は、95 ℃ 15 分間、および (95 ℃ 45 秒、60 ℃ 45 秒、72 ℃ 1 分間) を 35 サイクル、その後 72 ℃ 10 分間でした。得られた反応は、2% アガロース TAE ゲル内で 50 V で視覚化しました。得られた PCR 産物の自動配列決定は、Macrogen DNA Sequencing Inc. (ソウル、韓国) によって実施されました。 BioEdit ソフトウェア (Ibis Therapeutics、カールスバッド、米国) を使用して配列の品質をチェックし、国立バイオテクノロジー情報センターの非冗長データベース (www.ncbi.nlm. nih.gov) を使用して、得られた各分離株に最も近い種を検索します。

16 S rRNA および 18 S rRNA 単離遺伝子配列の系統解析は、log-expectation による多重配列比較によって配列をアライメントすることによって実行され、jModelTest で解析された後、Phylip NJ (ブートストラップ 10,000) によって解析されました。これはすべて、無料で利用できる Bosque 系統解析ソフトウェアのツールです。 (バージョン1.7.152)134. すべての単離遺伝子配列は、16 S rRNA (OP955639 ～ OP955657) および 18 S rRNA 配列 (OP954719 および OP962462) の両方について、NIH 遺伝子配列データベース (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) に寄託されています。）。

土壌の凍結乾燥サブサンプル (10 ～ 20 g) に、n-アルカン (テトラコサン-D50) および n-アルカン酸 (ミリスチン酸-D27) の内部標準を添加し、ジクロロメタンとメタノールの混合物 (DCM:/) で抽出しました。 MeOH、3:1、v/v) 超音波処理 (3 × 10 分サイクル)。ロータリーエバポレーションを使用して全脂質抽出物 (TLE) を約 0.5 ml に濃縮し、メタノール性カリウム (6% w/w) の混合物中で室温で一晩消化し、さらに中性画分と酸性画分に分離しました。中性脂質画分は、メタノール性カリウム混合物を 30 ml の n-ヘキサン (Hx) で 3 回抽出し、回転蒸発させて、約 1 ml の Hx:DCM (9:1、v/v) で回収することによって得られました。残りのメタノール性カリウム混合物にＨＣｌを添加し、３０ｍｌのＨｘで抽出することによって酸性脂質画分を得て（３回）、次いでロータリーエバポレーションを使用して濃縮し、ＤＣＭで収集した。中性画分の非極性（炭化水素）サブ画分と極性サブ画分へのさらなる分離は、あらかじめ燃焼させたパスツール中で約 0.5 g の Al2O3 粉末を使用し、アルミナカラムで濃縮中性画分（約 1 ml の Hx:DCM）を溶出することで行いました。 4.5 ml の Hx:DCM (9:1、v/v) および 3 ml の DCM:メタノール (1:1、v/v) をそれぞれピペットで加えます。非極性画分と酸性画分の両方を、ガスクロマトグラフィー質量分析法 (GC-MS)、Hx への直接注入 (前者)、または MeOH 中の BF3 で誘導体化して脂肪酸メチルエステル (FAME) を形成した後の注入によって分析しました。 GC-MS 分析は、70 eV での電子イオン化と m/z 50 ～ 650 のスキャンで動作する三軸検出器 (Agilent Technologies) を備えた 5975 VL MSD に接続された 6850 GC システムを使用して行われました。 1 μl の分析物が注入され、キャリアガスとして He を使用し、1.1 ml.m-1 の一定流量で HP-5MS カラム (30 mx 内径 0.25 mm x 膜厚 0.25 μm) で分離しました。非極性画分を分析するために、オーブン温度は、20 °C・min-1 で 50 °C から 130 °C まで徐々に上昇し、その後 6 °C・min-1 で 300 °C まで上昇するようにプログラムされました (20 分間保持) ）。酸性画分を分析するために、オーブン温度を 20 °C・min-1 で 70 °C から 130 °C にプログラムし、次に 10 °C・min-1 で 300 °C にプログラムしました (10 分間保持)。インジェクター温度は 290 °C、トランスファーラインは 300 °C、MS ソースは 240 °C に設定されました。化合物の同定は、質量スペクトルと標準物質の比較、および n-アルカン (C10 ～ C40) および脂肪酸メチルエステル (FAME; C8 ～ C24) の外部検量線を使用した定量化に基づいて行われました。すべての化学薬品と標準品は、Sigma Aldrich (米国ミズーリ州サンルイス) から供給されました。内部標準の回収率は平均 71 ± 14% でした。

有機炭素の安定同位体組成（δ13C）は、USGS 法 76 に従い、同位体比質量分析法（IRMS）を使用してバルク土壌サンプルで測定されました。簡単に言うと、すべてのサンプルを乳鉢と乳棒で粉砕することによって均質化しました。次いで、それらをＨＣｌ（３Ｎ）で脱炭酸し（土壌）、２４時間平衡化した後、超純水で中性ｐＨに調整した。サンプルは、重量が一定になるまでオーブン (50 °C) で乾燥させました。 δ13C とδ15N の比は MAT 253 IRMS (Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) で測定し、標準パーミル表記 (‰) で報告しました。 3 つの認定規格 (USGS41、IAEA-600、USGS40) が使用され、分析精度は 0.1 パーセントでした。全有機炭素含有量（TOC %）は、安定同位体の測定中に元素分析装置（HT Flash、Thermo Fisher Scientific、Waltham Massachusetts、USA）を使用して測定されました。

ラマンスペクトルは、波長 532 nm の非偏光 Nd:YAG 固体レーザーでサンプルを励起して実行されました。 1200 溝/mm の回折格子を備えたモノクロメーター (Horiba Jobin Yvon HRi550) に焦点を合わせた後、散乱光は熱ノイズ低減のために 203 K に冷却された 1024 × 256 ピクセルの電荷結合素子 (CCD) で検出されました。。分光計は、サンプル上で 42 μm のスポットサイズを可能にする 50 倍の対物レンズを備えた B&W Tek 顕微鏡 (Microbeam SA、スペイン) に光ファイバーで接続されています。スリット幅 200 μm のスペクトル分解能は 5 cm-1 より優れています。ラマンスペクトルは、レーザー出力範囲 20 ～ 150 mW、積分時間 10 ～ 100 秒、蓄積 3 回で取得されました。

レッドストーンサンプルの赤外線特性評価は、アルチェトリの INAF 天体物理観測所 (イタリア、フィレンツェ) で、Praying MantisTM 拡散反射アクセサリ (Harrick DRIFT) を備えたシングルビーム二重振り子干渉計 VERTEX 70 v (Bruker) を使用して実施されました。 out 拡散反射赤外フーリエ変換分光法 (DRIFTS) 分析。具体的には、解像度 4 cm-1、Globar 光源、KBr ビームスプリッター、DTGS 検出器を使用して、400 ～ 8000 cm-1 のスペクトル領域と、8000 ～ 20000 cm-1 のスペクトル領域の反射率スペクトルを取得しました。 SuperCam などの宇宙飛行機器に関連するスペクトル範囲全体をカバーするために、8 cm-1 の分解能、タングステン源、CaF2 ビームスプリッター、および InGaAs 検出器を使用します (スペクトル範囲 1.3 ～ 2.6 μm + 0.4 ～ 0.85 μm)。 NASA Mars 2020 探査車ミッション、Ma_MISS (スペクトル範囲 0.5 ～ 2.3 μm)、ISEM (スペクトル範囲 1.1 ～ 3.3 μm)、および MicroOmega (スペクトル範囲 0.95 ～ 3.65 μm + 0.5 ～ 0.9 μm)、ESA-Roscosmos ExoMars 2022 探査機に搭載ミッション。

レッドストーンサンプルをメノウ乳鉢で粉砕し、250μFT以下の粒子サイズを得るために、異なる細孔サイズのふるいのセットを使用してふるいにかけました。1064の励起源を備えたBruker RFS 100装置を使用してラマンを実行しました。 nmおよび100ミクロンのスポット。スペクトルごとに合計 1024 回のスキャンを使用して、2 つの異なる点からの 2 つのスペクトルが取得されました。 633 nm でのマイクロラマン分析。この目的のために、633 nm の励起光源と、集束/集光光学系として NIKON 顕微鏡が使用され、目的に応じて 25 ミクロンのスポットまでの可変スポットサイズの分析が可能になりました。高性能分光法は、Kaiser Optical Systems の Holospec 1.8i とラマンヘッドを使用して実行されました。オペレーターによる分析では、個々の粒子に焦点を当てて、主要成分の 4 つの異なるスペクトルが分析されました。 RLS シミュレータの場合、参考文献に記載されている自動システムを使用して、合計 100 個の 50 ミクロンスポットにわたる自動取得が行われました。 77.

ChemCam 機器の実験用レプリカを使用して、サンプルに対してそれぞれ 30 回のレーザーショットを 5 回観察しました。サンプルは装置から 1.6 メートル離れたところに設置され、火星の大気を模倣するために 7 Torr の CO2 で囲まれたチャンバー内に収められました。 LIBS データは、非レーザーバックグラウンドと連続体を除去し、波長を校正するために、78 に記載されている方法を使用して前処理されました。 TRLS (時間分解発光分光法) 観察は、SuperCam 機器の実験用レプリカを使用して行われました。

飛行様熱分解実験は、Quantum Analytics 社の Frontier Laboratories 3030D マルチショット熱分解装置を使用して実行されました。サンプルを粉末にし、アリコート (約 20 mg) をステンレス鋼の熱分解カップに入れました。サンプルは 35 °C/min で 40 °C から 850 °C まで加熱され、これは探査機 Curiosity 79 に搭載された火星装置サンプル分析 (SAM) で使用される熱分解ランプの速度を再現しました。ガスクロマトグラフィー質量分析 (GC-MS) 実験は、ISQ 四重極質量分析計 (どちらも Thermo Fisher 社製) に接続されたトレース 1310 GC で実施されました。 GC には、SAM で使用されているものと同様の Restek キャピラリー MXT-5 カラム (長さ 30 m x 内径 0.25 mm、厚さ 0.25 μm の固定相が結合) が装備されており、広範囲の分子 (~C5) の分析と分離が可能でした。 -C30)。 GC ランプを最初に 35 °C に加熱して 5 分間保持し、続いて 5 °C/min で 300 °C まで昇温し、2 分間保持しました。キャリアガスはヘリウムで、1.2 ml/分に設定されました。サンプルはスプリットレスモードで分析され、インジェクター、トランスファーライン、イオン源の温度はすべて 300 °C に設定されました。 MS は、m/z 40 ～ 535 amu の質量範囲をスキャンするように設定されました。熱分解の継続中、揮発性物質は、GC オーブン内の GC インジェクターの直後に配置されたガラス製液体窒素コールドトラップによってカラム入口で捕捉されました。熱分解が終了するまでにコールドトラップは停止して加熱され、GC 分析を開始できるようになります。潜在的な汚染を防止および制御するために、各単純な分析の間にブランクを実行しました。 MTBSTFA-DMF は、SAM 機器に存在する 2 つの湿式化学試薬のうちの 1 つです54。 MTBSTFA 誘導体化は、熱分解 GCMS では直接分析できない極性分子 (アミノ酸、脂肪酸など) の抽出と検出を容易にする非選択的シリル化技術であり、火星でも極性分子を検出できることが実証されています 80。 SAM 誘導体化実験は、熱分解カップに約 20 mg の固体サンプルを入れ、それ自体を 2 ml の開いたバイアルに入れることによって実験室で模倣されました。サンプルには、分析後の誘導体化効率を制御するための内部標準として使用される 40 nmol の DL-フルオロバリンがスパイクされました。次に、サンプルに吸着された水による MTBSTFA 試薬からの干渉を制限するために、サンプルを 40 °C で約 48 時間乾燥させました。熱分解分析の前に、20 uL の MTBSTFA-DMF をサンプルカップに入れ、バイアルを密閉した後、75 °C で 15 分間加熱しました。さらに、最初の SAM 加熱ステップを模倣するために、この温度は事前に最適化されており、標準極性分子の誘導体化に対して最も効率的であることが実証されています。加熱後、MTBSTFA 溶媒の蒸発を最小限に抑えるために、カップをすぐに熱分解装置に装填しました。次に、35 °C/分の SAM 加熱速度を使用して、SAM と同様の条件でサンプルを 75 °C から 850 °C まで加熱しました。クロマトグラフィーカラムを最初に 40 °C で加熱し (保持なし)、続いて最初の 10 °C/min で温度 80 °C まで上昇させ、続いて 2 回目の温度上昇を 5 °C/min で最終温度まで行いました。次の分析の前にカラムをベークアウトするために 310 °C で 5 分間保持します。熱分解実験に関しては、使用したキャリアガスはヘリウムで、試薬の飽和を制限するために 75 ml/分の分割流で 1.2 ml.min-1 の流量に設定しました。 MS イオン源とトランスファーラインは両方とも 300 °C に設定され、70 eV 電子イオン化源によって生成されたイオンは、40 ～ 535 の質量電荷比 (m/z) で 0.2 秒のスキャン時間でスキャンされました。 9 分 (溶媒遅延) から実行終了まで。

熱分解：すべての機器手順は、ISQ 四重極質量分析計 (Thermo Fisher) に接続された Trace Ultra ガスクロマトグラフのスプリット/スプリットレスインジェクターに取り付けられた Frontier Laboratories 3030D マルチショットパイロライザー (FrontierLab) を使用して実行されました。

各サンプル 20 mg を有機洗浄したスチールカップに入れて秤量し (マイクロスケール精度: 0.01 mg)、熱分解装置 (冷却) の上部に置きました。次に、カップを 400 °C または 600 °C に加熱した熱分解装置のオーブンに下げ、この温度で 30 秒間保持しました。サンプルのガス状内容物を、クロマトグラフィー分離のために、MOMA 様 MXT-5 カラム (長さ 20 m、内径 0.25 mm、固定相厚さ 0.25 μm) (Restek) に直接移しました。インジェクターを 250 °C に設定し、GC 温度プログラムを 40 °C で開始し、その後 10 °C ずつ上昇させました。 min−1 で最終温度 300 °C に達し、300 °C で 10 分間保持しました。質量分析計に関しては、イオン源とトランスファーラインの温度を 300 °C に加熱し、イオン源の電子ビームを 70 eV に設定して、イオンの質量電荷比 (m/z) を 10 ～ 600 までスキャンしました。

誘導体化: すべてのサンプルは、MOMA 機器スイートに存在するシリル化試薬、N,N-メチル-tert-ブチル-ジメチルシリルトリフルオロアセトアミド (MTBSTFA) を使用して誘導体化されました。 N,N-ジメチルホルムアミド (DMF) を溶媒として MTBSTFA (1:4) に添加し、誘導体化反応の促進を助けました 81。誘導体化の 2 つの方法、すなわち直接誘導体化法と誘導体化前の抽出を実施しました。

直接誘導体化。各サンプル 50 mg をガラスバイアルに移しました (マイクロスケール精度: 0.01 mg)。１００μＬの誘導体化試薬および１μＬの内部標準（酢酸エチル中１０−２Ｍのラウリン酸メチル）を添加した。次いで、溶液を75℃で15分間加熱した。 0.5 μL の上清を GCMS 装置に手動で注入しました。

抽出方法；熱分解実験では、サンプル中に存在する有機物が存在しないか、存在量が非常に少ないことが判明したため、有機分を濃縮するために誘導体化の前に抽出を進めました。 50 mg のサンプルをガラスバイアルに移しました (マイクロスケール精度: 0.01 mg)。アミノ酸などの水溶性化合物や、脂肪酸などの有機溶媒への溶解度が高い他の有機物を抽出するために、水とメタノールの（1:1）溶液250μlをサンプルに添加しました。水漏れを防ぐためにねじ込みキャップをパラフィルムでさらに密閉し、バイアルを超音波浴 (Branson 2200) に 2 時間入れました。次いで、溶液をエッペンドルフチューブに移し、遠心分離して相を分離した。液相が蒸発するまで、窒素流下で管を 75 °C で加熱しました。 50μLの誘導体化剤および1μLの内部標準(以前と同じ)を添加した。サンプルを 75 °C で 15 分間加熱し、0.5 μL の上清をマイクロシリンジを使って手動で GC に注入しました。加熱によるエッペンドルフチューブからの化学汚染物質の潜在的な存在をコントロール GC-MS によって評価しましたが、汚染は検出されませんでした。実験の再現性を保証するために、両方の方法のサンプルごとに 2 つのレプリカが作成されました。すべての機器手順は、TSQ 9000 トリプル四重極質量分析計に接続された Trace 1300 ガスクロマトグラフで実行されました。 Restek の標準 RTX-5 カラム (長さ 30 m、内径 0.25 mm、固定相の厚さ 0.25 μm) を使用しました。温度プログラムと質量分析計のパラメーターは熱分解実験の場合と同じでした。

惑星探査用に開発された SOLID (Signs of Life Detector) 機器の中核である 200 個の抗体マイクロアレイベースの免疫センサー (LDChip または Life Detector Chip) は、多種多様で分子サイズの微生物バイオマーカー、主にポリマーをターゲットとしています 82,83,84 。ポリクローナル抗体の IgG 画分は、前述のように 9 個の完全な LDChip をスライドごとに設定できるように、顕微鏡ガラススライド上の 3 重のスポットパターンマイクロアレイにプリントされました 85。 LDChip 上の抗体の完全なリストは、参考文献にあります。 86. 固体粉砕サンプルは、SOLID 機器による自動香料処理と同様の手順に従って処理されました。簡単に説明すると、0.5 g を Twin20 二重強化 (TBSTRR) 緩衝液 (0.4 MTris-ClH、pH 8、0.3 M NaCl、0.1% Tween 20) を含む溶解/インキュベーショントリス緩衝生理食塩水 2 mL に再懸濁し、3 × 1 分間超音波処理しました。パルスを加え、20 ミクロンでろ過して粗大粒子状物質を除去します86。次に、50 uL の各粗抽出物を、SOLID サンプル分析ユニット (SPU) をシミュレートするマルチアレイ分析モジュール (MAAM)71 の対応する各チャンバー内で LDChip とともに 4 °C で 8 時間インキュベートしました。ブランクコントロールにはバッファーのみが含まれていました。 TBSSTRR緩衝液で洗い流した後、すべてのチャンバーを、免疫反応のトレーサーとして、蛍光標識抗体（各0.5〜1μg/mL）の混合物50μLとともに4℃で12時間インキュベートした。洗い流して乾燥させた後、他の場所で説明されているように、チップの蛍光がスキャンされ、画像が処理され、定量化され、分析されました 85,86。

データと資料の入手可能性: すべてのデータとサンプルは、AAB へのリクエストに応じて無料で入手できます。すべての NGS 生配列データは、アクセッション番号 PRJNA908755 で NCBI Sequence Read Archive (SRA、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) に寄託されました。すべての単離遺伝子配列は、16 S rRNA (OP955639 ～ OP955657) および 18 S rRNA 配列 (OP954719 および OP962462) の両方について、NIH 遺伝子配列データベース (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) に寄託されています。）。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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これらの結果につながった研究は、欧州研究評議会、AGF へのコンソリデーター助成金番号 818602、および AA-B へのヒューマンフロンティア科学プログラム助成金番号 RGY0066/2018 によって資金提供されたプロジェクト「MarsFirstWater」からの貢献です。追加の資金提供は、MINECO 助成金 PID2019-107442RB-C32 (OP-B. および AM)、日本学術振興会科学研究費補助金助成金番号 17H06458 および 21H04515 (KF)、助成金番号 17H06456 によって提供されました。、17H06458、20H00195、および21H04515 (KFおよびYS)、Consejería de Educación e Investigación、Comunidad Autónoma de Madroid/欧州社会基金プログラム(MAFM)、助成金番号ESP2017-87690-C3-3-R (DC)、Ramón yカハル認可番号 RYC2018-023943-I (LS-G.)、AEI 認可 MDM-2017-0737 および MCIN/AEI 認可 PID2019-107442RB-C32 (VM-I.)、MCIU/AEI (スペイン) および FEDER (UE) ) 助成金番号 PGC2018-094076-B-I00 (JW および CA)、イタリア宇宙庁協定 2017-48-H.0 (TF、JRB および GP)、スペイン科学省助成金 PID2019-107442RB-C31 (JAM) 、MV、GLR、AA、FR）、スペイン大学省（MFM）の資金提供によるマリア・ザンブラノ優秀助成プログラム（CA3/RSUE/2021-00405）、NASA火星探査プログラム契約NNH13ZDA018O、NNH15AZ24I、NNH13ZDA018OおよびLANL研究所指定研究開発 (LDRD) は XX5V (AMO、RCW、AR および SMC) に資金提供し、NASA-GSFC は NNX17AJ68G (MM および SSJ) を助成し、NES は火星科学研究所ミッションの火星でのサンプル分析に焦点を当て、火星有機分子分析装置はExomars 2022 ミッション (OM、CS、CF)、およびスペイン省による助成金 RTI2018-094368-B-I00 および MDM-2017-0737 Unidad de Excelencia "Maria de Maeztu"- Centro de Astrobiología (INTA-CSIC) Science and Innovation/State Agency of Research MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033、および「ERDF ヨーロッパを作る方法」 (CE、MGV、MM-P.、および VP) による。 RCW は、LIBS データの前処理を実行してくれた Dot Delapp に感謝します。著者らはまた、Sentinel 2020 の衛星データを提供してくれた USGS Earth Explorer に感謝します。

宇宙生物学センター (CAB) (CSIC-INTA)、28850、マドリッド、スペイン

アルマンド・アズア＝ブストス、アルベルト・G・フェアレン、オルガ・プリエト＝バレステロス、ダニエル・カリソ、ローラ・サンチェス＝ガルシア、ビクトル・パロ、クリスティーナ・エスクデロ、ビクトリア・ムニョス＝イグレシアス、マイテ・フェルナンデス＝サンペドロ、アントニオ・モリーナ、ミリアム・ガルシア・ビジャダンゴス、メルセデス・モレノ＝パス

チリ自治大学保健科学部生物医科学研究所、サンティアゴ、チリ

アルマンド・アズア＝ブストス

コーネル大学天文学部、イサカ、14853、ニューヨーク州、米国

アルベルト・G・フェアレン

チリ、アリカ、タラパカ大学理学部

カルロス・ゴンザレス・シルバ

マドリッド自治大学生態学部、28049、マドリッド、スペイン

ミゲル・アンヘル・フェルナンデス＝マルティネス

国立自然科学博物館 (CSIC)、28006、マドリッド、スペイン

ヤツェク・ヴィエルチョス & カルメン・アスカソ

INAF - イタリア、フィレンツェのアルチェトリ天体物理天文台

テレサ・フォルナーロ、ジョン・ロバート・ブルカート、ジョバンニ・ポジャーリ、オフェリー・マッキントッシュ

バリャドリッド大学、バリャドリッド、スペイン

ホセ・アントニオ・マンリケ、マルコ・ベネランダ、ギジェルモ・ロペス＝レイエス、アウレリオ・サンス＝アランス、フェルナンド・ルール

天体物理学・惑星学研究所 (IRAP)、トゥールーズ、フランス

ホセ・アントニオ・マンリケ

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アン・M・オリラ、ロジャー・C・ウィーンズ、サミュエル・M・クレッグ

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マエバ・ミラン

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エリザベス・ランペ

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アルマンド・アズア＝ブストスへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Hamidah Idris 氏、Carol Stoker 氏、およびその他の匿名の査読者に感謝します。査読者レポートが利用可能です。

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転載と許可

Azua-Bustos, A.、Fairén, AG、González-Silva, C. 他アタカマ化石デルタに含まれる暗い微生物叢と極度に少ない有機物により、火星生命の検出限界が明らかになりました。 Nat Commun 14、808 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-36172-1

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受信日: 2022 年 6 月 28 日

受理日: 2023 年 1 月 17 日

公開日: 2023 年 2 月 21 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36172-1

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