海水中の水素分子が多様な海洋細菌の増殖をサポート

Nature Microbiology volume 8、pages 581–595 (2023)この記事を引用

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483 オルトメトリック

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分子状水素 (H2) は海洋システムにおいて豊富で容易にアクセスできるエネルギー源ですが、海洋微生物群集がこのガスを消費するかどうかは不明のままです。 今回我々は一連のアプローチを用いて、海洋細菌がH2を消費して成長をサポートしていることを示した。 H2 取り込みヒドロゲナーゼの遺伝子は地球規模の海洋メタゲノムに蔓延しており、メタトランスクリプトームで高度に発現しており、8 つの細菌門にわたって見られます。 H2 の酸化能力は深さとともに増加し、酸素濃度とともに減少します。これは、一次生成量が少ない環境では H2 が重要であることを示唆しています。 熱帯、温帯、亜南極の海域と無菌培養物の生物地球化学的測定では、海洋微生物が環境に適切な濃度で供給されるH2を消費し、低エネルギー要求で細菌の増殖をサポートするのに十分な細胞固有の力を生み出すことが示されている。 逆に、我々の結果は、一酸化炭素 (CO) の酸化が主に生存をサポートしていることを示しています。 全体として、H2 は海洋細菌にとって注目すべきエネルギー源であり、海洋生態学と生物地球化学に影響を与える可能性があります。

過去 10 年間にわたり、微量ガスは陸上生態系における好気性細菌の成長と生存をサポートする主要なエネルギー源として浮上してきました。 2 つの微量ガス、分子状水素 (H2) と一酸化炭素 (CO) は、その遍在性、拡散性、エネルギー収量を考慮すると、特に信頼できる基質です 1。 細菌は、好気性呼吸鎖に結合したグループ 1 および 2 [NiFe]-ヒドロゲナーゼおよび I 型一酸化炭素デヒドロゲナーゼを使用して、大気濃度以下を含むこれらのガスを酸化します 2、3、4、5、6。 微量のガス酸化により、多様な有機従属栄養細菌は、好ましい有機成長基質の長期欠乏にも耐えることができます 7,8。 さらに、さまざまな微生物は、微量ガスを他の有機または無機エネルギー源と共酸化することによって混合栄養的に増殖することができます7、9、10。 これまでのところ、8 つの異なる門の細菌が周囲レベルの H2 と CO を消費することが実験的に示されており 1、他の多くの細菌もこのプロセスの決定因子をコードしています 6,11。 生態系スケールでは、土壌生態系内のほとんどの細菌は微量ガス酸化の遺伝子を保有しており、細胞固有の微量ガス酸化速度は理論的には細菌の生存を維持するのに十分です 12,13。 しかし、これらの研究のほとんどは土壌環境または分離菌に焦点を当てているため、微量ガス酸化のより広範な重要性はほとんど解明されていないままです。

微量ガスは、ほとんどの土壌とは対照的に、一般に大気と比べて高い濃度で利用できるため、海洋細菌にとって重要なエネルギー源である可能性があります1。 世界の海洋の表層は一般に H2 と CO が過飽和であり、通常は大気と比べてそれぞれ 2 ～ 5 倍 (最大 15 倍) と 20 ～ 200 倍 (最大 2,000 倍) です14。 15、16、17。 その結果、海洋はこれらのガスの大気への正味排出量に寄与しています18,19。 CO は主に溶解有機物の光化学酸化によって生成されます 20 が、H2 は主にシアノバクテリアの窒素固定によって生成されます 21。 低酸素堆積物での発酵中には高濃度の H2 も生成され、これらの高濃度は、特に沿岸水域で、上層の水柱に拡散する可能性があります 22。 未解決の理由により、これらのガスの分布は緯度によって異なり、逆の傾向を示します。極水では溶存 CO が高度に過飽和であるのに対し、H2 は飽和度が低いことがよくあります 23,24,25,26,27,28。 これらの変動はおそらく、異なる気候における微量ガスの生成と消費の相対的な速度の違いを反映していると考えられます。

海洋微生物群集が CO を消費することは長い間知られていましたが、その H2 利用能力は体系的に評価されていませんでした 29。 海洋表層水中の細菌細胞の約 4 分の 1 が表層水中の CO デヒドロゲナーゼをコードしており、これらは世界的に豊富に存在するロドバクテラ科 (以前は海洋ロゼオバクター分岐群として知られていた) を含む幅広い分類群に及びます 6、30、31、32、33。 土壌群落について行われた観察に基づいて、CO 酸化は有機炭素欠乏期間中の海洋細菌の長期生存を潜在的に強化する可能性があります6。 一貫して、培養ベースの研究は、CO が海洋分離株の成長に影響を及ぼさないことを示していますが、原因となる酵素の生産は飢餓中に強く上方制御されます 34,35,36,37。 H2 の好気性および嫌気性酸化は、底生および熱水噴出孔群集で広く報告されていますが、これまでのところ、遠洋細菌群集がこのガスを利用できるかどうかを示した研究はありません。 いくつかの調査により、海水サンプルおよび分離株から潜在的な H2 酸化ヒドロゲナーゼが検出されました 6、11、40、43。 トリコデスミウムなどの海洋分離菌を含むシアノバクテリアが H2 を酸化することはよく報告されていますが、このプロセスはニトロゲナーゼ反応によって生成される H2 の内因性リサイクルに限定されていると考えられています 44,45。

この研究では、海洋細菌によるH2とCOの酸化のプロセス、分布、メディエーター、および潜在的な役割を調査することで、これらの知識のギャップに対処しました。 そのために、全球のタラ海洋メタゲノムとメタトランスクリプトームの分析に加えて、温帯海洋トランセクト、温帯沿岸トランセクト、熱帯の島から収集した 14 個のサンプルのメタゲノムおよび生物地球化学的プロファイリングを並行して実行しました 46。 また、3 つの無菌海洋細菌分離株が大気中の H2 を好気的に消費する能力もテストしました。 まとめると、我々は、H2 が海洋細菌の増殖を支える見過ごされている重要なエネルギー源であるという、生態系規模と文化に基づいた決定的な証拠を提供します。

我々は、14 の表層海水サンプル中の H2 と CO の現場濃度と現場外酸化速度を測定しました。 サンプルは3つの場所から収集されました（補足図1）：ネライト、亜熱帯、亜南極の前線水域にまたがる海洋トランセクト（ニュージーランド沖のムニダトランセクト; n = 8;補足図2）。 温暖な都市部の湾 (ポートフィリップ湾、オーストラリア、n = 4)。 熱帯のサンゴ礁 (オーストラリア、ヘロン島、n = 2)。 これらの緯度における世界的な傾向と一致して、両方のガスはすべてのサンプルにおいて大気と比較して過飽和でした。 H2 は海洋トランセクト (2.0 ± 1.2 nM)、温帯湾 (1.8 ± 0.26 nM)、熱帯島 (4.6 ± 0.3 nM) でそれぞれ 5.4 倍、4.8 倍、12.4 倍過飽和でした。 CO は海洋トランセクトでは中程度の過飽和 (5.2 倍、0.36 nM ± 0.07 nM) でしたが、温帯湾 (123 倍、8.5 ± 1.7 nM) と熱帯の島 (118 倍、8.2 ± 0.93 nM) の両方では高度に過飽和でした。 ）。

微量ガスの微生物による酸化は、採取されたサンプルの 1 つを除くすべてで、現場外でのインキュベーション中に検出されました (図 1)。 温帯湾の場合、H2 と CO は海岸、中間地帯、湾中心部から収集された水サンプルで消費されました (図 1a)。 現場のガス濃度に基づくと、CO のバルク酸化速度は H2 より 18 倍速かった (P < 0.0001) (補足表 1)。 バルク酸化速度は、表面の微小層（つまり、大気と海洋の間の 1 mm の界面）とその下にある水の間で大きな違いはありませんでした。 H2 と CO の酸化は、熱帯の島から収集された表面の微小層とその下の海水サンプルでも明らかでした（補足図 3）。 同様に、マルチフロントのムニダ海洋トランセクト全体で急速な二酸化炭素消費と遅い水素消費が観察されましたが、予想外に、これらの活動は相互に排他的でした。 正味の CO 酸化は沿岸海域および亜熱帯海域全体で発生しましたが、亜南極海域では無視できました。 逆に、正味の H2 酸化は亜南極海域でのみ発生しました (図 1b)。 対照的な物理化学的条件を伴う水塊におけるこれらの異なる酸化速度は、地球規模の海水中の H2 と CO の対照的な濃度を説明するのに役立つ可能性があります 23,24,25,26,27,28 が、これを確認するにはより広範なサンプリングとその場での分析が必要となります。 インキュベーション中に主に窒素固定を通じて内因性 H2 生成が依然として存在するため、これらの測定はおそらく H2 酸化の速度を過小評価し、閾値を過大評価していることに注意する必要があります。 それにもかかわらず、彼らは海洋水柱における H2 酸化に関する最初の経験的報告を提供しました。

a、b、結果は、オーストラリアのビクトリア州ポートフィリップ湾のトランセクトの4つのサンプル(a)と、ニュージーランドのオタゴ沖のムニダトランセクトの8つのサンプル(b)について示されています。 各 120 ml の密閉血清バイアルには、約 2.5 ppmv の H2 または CO を補充した 60 ml の周囲空気ヘッドスペースでインキュベートした 60 ml の天然海水サンプルが含まれていました。各時点で、各バイアルのヘッドスペース内の各ガスの混合比を測定しました。ガスクロマトグラフで分析し、溶存ガス濃度 (nM) に変換します。 データは、生物学的に独立した 3 つのサンプルの平均値 ± 標準誤差として表示されます。

ソースデータ

これらの活動の基礎をよりよく理解するために、14 のサンプル (補足表 2 および 3) のメタゲノムの配列を決定し、相同性に基づく検索を使用して、メタゲノム リード (補足表 3) およびアセンブリ内の 50 の代謝マーカー遺伝子の存在量を決定しました (補足表4)。 他の表層海水群集と同様に47、群集の構成（補足図4）と代謝遺伝子（図2）の分析は、存在するほとんどの細菌がエネルギー変換ロドプシンを介して好気呼吸、器官従属栄養性、光栄養性が可能であることを示唆しています。 好気性 CO 酸化能力は中程度であった。細菌細胞および古細菌細胞の約 12% が coxL 遺伝子 (I 型 CO デヒドロゲナーゼの触媒サブユニットをコードしている) をコードしていたが、相対存在量は CO 酸化が活発な温帯湾の平均 25% から減少した。 CO酸化は無視できるほどである（図1）亜南極海域では5.1%まで非常に活性が高かった（図2）。 水素栄養呼吸、水素栄養炭素固定、水素発生発酵および H2 センシングをサポートすることが知られているサブグループを含む、多様なヒドロゲナーゼもコミュニティによってコードされていました (補足表 3)。 グループ 1d、1l、および 2a [NiFe]-ヒドロゲナーゼ (ここでは好気性 H2 取り込みヒドロゲナーゼ) は、細胞が H2 から好気性呼吸鎖に電子を入力できるようにします 4,9,48,49 が、H2-ヒドロゲナーゼの中で最も豊富でした。酸化酵素（図2）。 平均して海洋細菌の 1.0% によってコードされているこれらのヒドロゲナーゼ サブグループの存在量は、熱帯島のサンプルで最も高く (平均 3.5%)、海洋トランセクトからの亜熱帯および亜熱帯のサンプルでは 0.11% に減少しました (図 2)。これらのサンプル間の対照的なH2酸化速度と一致します（図1および補足図3）。 優勢なヒドロゲナーゼのサブグループはサンプル間で異なり、熱帯の島のサンプルではグループ 1d、温帯の海岸および微層サンプルではグループ 2a、亜南極のサンプルではグループ 1l でした (図 2)。 H2 および CO 酸化細菌の相対的な存在量は、各ガスの酸化速度を強く予測しました（R2 はそれぞれ 0.55 および 0.88、P 値はそれぞれ 0.0059 および <0.0001）（補足図 5）。ただし、遺伝子発現の抑制が影響している可能性があります。一部のサンプルの無視できる程度の活性に寄与します。

代謝マーカー遺伝子の豊富さは、3 つの研究サイトからサンプリングされた海水全体のメタゲノム ショート リード (左; n = 14)、タラ海洋データセットからのメタゲノム ショート リード (中央; n = 213; 反復の平均) に基づいて示されています。 ）およびタラ海洋データセットからのメタトランスクリプトームのショートリード（右、n = 89、複製の平均）。 相同性ベースの検索を使用して、メタゲノムの生物ごとの平均遺伝子コピーとしてマーカー遺伝子の相対存在量を計算しました（普遍的な単一コピーマーカー遺伝子のセットと比較した存在量。特定の遺伝子をコードするコミュニティの推定割合に相当します）。単一コピー）とメタトランスクリプトームの RPKM。 複数のマーカー遺伝子がリストされている場合、値は合計されます。 下のパネルは、各サンプルに存在するヒドロゲナーゼのサブグループを示しています。 SUR、表面。 DCM、深部クロロフィル最大値。 MES、中遠洋海洋層。

ソースデータ

これらの観察が世界的に代表的なものであるかどうかをテストするために、タラ海洋データセットにおける H2 および CO 酸化の遺伝子の分布と発現を決定しました 47,50。 私たちのメタゲノムと同様に、好気性 H2 取り込みヒドロゲナーゼは、213 のタラ オーシャンズ メタゲノム全体で平均 0.8% の細菌と古細菌によってコードされていましたが、I 型 CO デヒドロゲナーゼは 10.4% によってコードされていました。 これらの遺伝子は、紅海と地中海だけでなく、4 つの海洋すべてにわたるサンプルで観察されました (図 2)。 メタゲノムに基づくとヒドロゲナーゼ転写物の存在量は比較的少ないにもかかわらず、メタトランスクリプトームではヒドロゲナーゼ転写物が非常に多く、ニトロゲナーゼ（nifH）転写物と同等のレベルでした（図2および補足表3）。 好気性 H2 取り込みヒドロゲナーゼの発現比 (平均 RNA:DNA 比) は高く、グループ 1d、1l、および 2a [NiFe]-ヒドロゲナーゼではそれぞれ 2.2、1.1、および 12.9 でした (補足表 3)。 調査したマーカー遺伝子のうち、光栄養性 (psaA、psbA、エネルギー変換ロドプシン)、硝化 (amoA、nxrA)、および CO2 固定 (rbcL) の決定因子のみが、グループ 2a [NiFe]-ヒドロゲナーゼよりも高い比率で発現されました。 対照的に、CO デヒドロゲナーゼ (0.9)、および水素栄養性炭素固定、水素生成発酵、および H2 センシングに関与するヒドロゲナーゼの発現レベルは比較的低かった (すべてのケースで平均 RNA/DNA < 1) (補足表 3)。 生物地球化学的測定 (図 1) と併せて、これらの発見は、H2 酸化細菌が、その存在量が比較的少ないにもかかわらず、海水中で非常に活性である可能性があることを示唆しています。

その後、ローカルデータセットと、タラオーシャンデータセット（図3a）から以前に報告された1,888個のMAG（図3aおよび補足図6）から構築された110のメタゲノムアセンブリゲノム（MAG）における代謝マーカー遺伝子の分布を決定しました。 好気性 H2 取り込みヒドロゲナーゼの 3 系統は系統発生的に広く分布しており、9 門、26 目に及ぶ細菌 MAG の 75 (4.0%) によってコードされていましたが、CO デヒドロゲナーゼの分布はやや狭く、70 (3.5%) MAG でした。 、6 門と 14 目 (補足表 5)。 好気性H2取り込みヒドロゲナーゼとCOデヒドロゲナーゼは、どちらもプロテオバクテリア、バクテロイドータ、アクチノバクテリオタ、クロロフレクソタ、ミクソコッコタ門および候補門SAR324内のMAGによってコードされており、ヒドロゲナーゼはシアノバクテリア、プランクトミセトータ門およびエレミオバクテロータ門のMAGにも存在していました（図3a）。 系統樹は、H2酸化グループ1および2 [NiFe]-ヒドロゲナーゼ（図3bおよび補足図7）、双方向グループ3および4 [NiFe]-ヒドロゲナーゼ（補足）の触媒サブユニットの進化の歴史と分類学的分布を示しています。図8）およびCOデヒドロゲナーゼ（補足図9）。

a、3 つの研究サイト (110 MAG) から構築され、タラ オーシャンズ データセット (1,877 MAG) について以前に報告された、メタゲノムで組み立てられたゲノムの代謝ポテンシャルを示すバブル プロット。 MAG は門レベルで要約され、円の大きさは特定の遺伝子を持つその門のゲノム数に対応し、色はゲノム完全性のパーセンテージを反映します。 どのMAGでも検出されなかったマーカー遺伝子は省略してあります。 b、グループ 1 および 2 [NiFe]-ヒドロゲナーゼの触媒サブユニットの最尤系統樹。 新しい MAG (緑色) および Tara MAG (青色) から取得されたヒドロゲナーゼ配列を、3 つの培養海洋細菌 (赤色の名前) を含む代表的な参照配列 (黄色) と並べて表示します。 進化の歴史は JTT マトリックスベースのモデルを使用して推論され、ツリーは 50 回の複製を使用してブートストラップされ、アウトグループ グループ 4a [NiFe]-ヒドロゲナーゼ シーケンスを使用してツリーがルート化されました。 このツリーには、好気呼吸 (グループ 1d、1f、1l、2a)、嫌気呼吸 (グループ 1a、1b、1c、1e)、および H2 センシング (グループ 2b および 2c) に関与するヒドロゲナーゼのサブグループが含まれています。

ソースデータ

ゲノム情報と広範な文献を統合すると、H2 と CO の酸化が海洋生態系における無数のライフスタイルをサポートしている可能性があります。 グループ 1d [NiFe]-ヒドロゲナーゼは、通常、複数のロドバクテリウム科、アルテロモナダ科、およびその他のプロテオバクテリアの MAG において、リブロース 1,5-二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ (RuBisCO) および感覚グループ 2b [NiFe]-ヒドロゲナーゼの両方と共コードされていました (図.3b および補足表 5); これは、培養ベースの研究におけるこれらのヒドロゲナーゼの以前に記載された役割と一致して、この酵素がH2富化水中での水素栄養増殖をサポートしていることを示唆しています11、38、51。 グループ1l [NiFe]-ヒドロゲナーゼは、南極の塩分土壌からのバクテロイドタ属分離株の存続を支持することが最近示されており4、バクテロイドタ属からの予測された器官従属栄養生物であるSAR324によってコードされており、培養分離株に基づいてプロテオバクテリアによってコードされていた（図3bおよび補足表） 5)。 グループ 2a [NiFe]-ヒドロゲナーゼは、多様な細菌の混合栄養増殖をサポートすることが知られています9が、系統発生的により多様で、分類学的に広範囲に分布していました。 それらは、予測された化学有機従属栄養生物（バクテロイド門、粘液菌門、プロテオバクテリア）と光石独立栄養生物（シアノバクテリア）の両方のMAGに分布していました（図3bおよび補足表5）。 CO デヒドロゲナーゼは主にロドバクテラ科に属しており、Nanopelagicales S36-B12、Puniceispirillaceae、SAR324 NAC60-12、および Ilumatobacteraceae の複数の MAG によってもコードされていました（補足図 9）。 coxLをコードするMAGのうち、63%はエネルギー変換ロドプシンまたは光化学系IIの遺伝子もコードしており、これは、これまでの培養に基づく知見を裏付けるように、それらがCOと光の両方から同時にまたは交互にエネルギーを収集できることを示している37。 これらの MAG のほとんどは偏性従属栄養生物であると予測されますが、7% は RuBisCO もコードしており、理論的にはカルボキシド栄養性成長が可能です (補足表 5)。 これらの発見は、海域の生息地のジェネラリストが補助エネルギー源として溶存二酸化炭素を消費するなど、代謝の柔軟性から恩恵を受けているというこれまでの推論を裏付けるものである31,52。

私たちは 2 つの熱力学モデリング計算を使用して、測定された H2 および CO の酸化速度が細胞の成長または生存をどの程度維持するかを推定しました。 まず、主に共生栄養性分離株の測定に基づいて細胞当たりの維持エネルギーの中央値が 1.9 × 10−15 ワット (W) であると仮定すると 53、測定された酸化速度は理論的には平均 2.0 × 107 個の H2 酸化細胞 (範囲 1.4 × 106 ～現場溶存ガス濃度で 1 リットルあたり 8.3 × 107) および 6.1 × 107 CO 酸化セル (2.1 × 106 から 1.5 × 108 の範囲) (補足表 1)。 次に、観測された微量ガス酸化速度（図1および補足表1）と微量ガス酸化剤の予測数（図2および補足表1）に基づいて生成される電力量（つまり、セルあたりのW）を計算しました。表 1) はサンプリングされた水の結果であり、この分析は酸化が観察され、信頼性の高い細胞数が得られるサンプルに限定されています。 平均して、その場で測定された CO および H2 濃度の酸化により、セルあたり 7.2 × 10−16 W および 5.8 × 10−14 W が得られます (図 4)。 これらの分析を総合すると、CO の酸化速度は、このガスを利用できると予測される多数の細菌の生存を維持するのに十分であるが、増殖を維持するのに十分であることが示唆されます。 これは、CO デヒドロゲナーゼが主に有機従属栄養細菌の存続をサポートしているというこれまでの推論を裏付けています6。

a、b、結果は、CO 酸化 (a) (n = 10 (速度) および n = 7 (電力) 生物学的に独立したサンプル) および H2 酸化 ( b) (n = 7 (レート) および n = 4 (検出力)、生物学的に独立したサンプル)。 この分析は、微量のガス酸化が測定可能なサンプルに対してのみ実行され、細胞固有の出力は原核生物の細胞数が利用可能なサンプルに対してのみ計算されました。 速度と出力は、環境に関連したさまざまな濃度の CO および H2 濃度に基づいて表示されます。 中央の値は中央値を示し、ボックスは上位四分位数と下位四分位数を示し、ひげは最大値（上位四分位点プラス四分位範囲の 1.5 倍）と最小値（下位四分位点マイナス四分位範囲の 1.5 倍）を示します。

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対照的に、海洋の H2 酸化剤は、比較的特殊な基質を細胞固有の急速な速度で酸化することで、おそらく成長をサポートするのに十分な力を発揮します。 最も活性な H2 酸化剤を含むサンプルで生成される細胞固有の電力 (5.4 × 10−13 W、最初の亜南極基地から) は、増殖中の細菌分離株の細胞代謝率について報告されている範囲 (中央値: 2.6 × 10−13 W) 内にあります。 14 W; 範囲: 2.8 × 10−17 ～ 2.1 × 10−11 W)、共栄養性海洋分離株 Vibrio sp. よりも高い。 DW1 (3.2 × 10−14 W) および V. anguillarum (1.8 × 10−13 W)53。 群集データからの細胞固有の出力の推定は、無菌培養から得られる推定よりも正確ではありませんが、これらの細胞あたりの出力の計算は、微量ガスの内部循環を考慮しておらず、すべての細胞が同等に活性であると仮定しているため、おそらく過小評価されています。遺物の DNA は考慮しません。 図 4 に示すように、H2 と CO が空間と時間にわたって一時的に高度に上昇すると、細胞ごとに得られる出力が大幅に増加することにも注意してください。このような熱力学モデリングは、海洋中の少数の細菌が、好気呼吸や場合によっては CO2 固定のための電子供与体として H2 を使用して増殖できることを強く示唆しています。 H2 酸化から得られるエネルギーに主に依存することで、海洋細菌は有機炭素の大部分を呼吸ではなく生合成に割り当てる可能性があります。つまり、主に石従属栄養的な生活様式を採用している可能性があります。

海洋 H2 酸化のメディエーターと役割をより深く理解するために、MAG のものと密接に関連した取り込みヒドロゲナーゼをコードする 3 つの従属栄養性海洋分離株による H2 取り込みを調査しました (図 3)。 Robiginitalea biformata DSM-15991 (Flavobacteriaceae) 54 と Marinovum algicola FF3 (Rhodobacteraceae) 55 の 2 つの株は、グループ 11 [NiFe]-ヒドロゲナーゼをコードしているにもかかわらず、さまざまな条件にわたって 3 週間にわたって実質的に H2 を消費しませんでした。 これらの急速に増殖する実験室適応分離株においてヒドロゲナーゼが機能しなくなったのか、それとも非常に特殊な条件下でのみ活性を示すのかは不明である。 Sphingopyxis alaskensis RB2256 (スフィンゴモナダ科) 56,57 は、プラスミド保有のグループ 2a [NiFe]-ヒドロゲナーゼをコードしており、一次速度論的プロセスで H2 を大気レベル以下まで好気的に消費しました (図 5)。 S. alaskensis は貧栄養の極地水域に豊富に存在し、非常に小さな細胞 (<0.1 µm3) を形成し、流線型のゲノムを持っているため、複製に必要な資源は最小限ですみます 57、58、59、60。 これまで偏性有機従属栄養生物であると考えられていた 61 が、この貧栄養性の非常に小さな細菌 (超ミクロバクテリウム) 62 がエネルギー源として豊富な還元ガスを使用しているという発見により、その生態学的成功がさらに合理化されました。 これはおそらく、海洋細菌による大気中の H2 酸化に関する最初の報告である。

a、Difco 2216 Marine Brothで増殖させたS. alaskensisの増殖曲線。 培養物のガス消費量をテストし、対数期（17 時間、OD600 = 0.66）および定常期（168 時間、ODmax 後 4 日）の RT-qPCR 用に収集しました。 データは平均±標準偏差、n = 3 の生物学的に独立したサンプルとして表示されます。 b、 S. alaskensis の指数期および定常期培養物における RT-qPCR によって測定された、グループ 2a [NiFe]-ヒドロゲナーゼ大サブユニット遺伝子 (hucL; 遺伝子座 Sala_3198) の転写物の数。 条件ごとの 3 つの生物学的反復 (2 つの技術的反復の平均) の平均 ± SD。 この比較は、対応のない両側 t 検定に基づいて統計的に有意です (**P = 0.0062)。 c、S. alaskensis の指数関数的および定常期培養による H2 酸化。 培地のみのバイアルを陰性対照としてモニターした、3 つの生物学的複製の平均 ± SD。 点線は大気中の水素濃度 (0.53 ppmv) を示します。

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次に、S. alaskensis が主に混合栄養増殖または生存をサポートするために H2 酸化を使用するかどうかを決定しました。 そのヒドロゲナーゼ大サブユニット遺伝子 (hucL) の発現は、逆転写定量的 PCR (RT-qPCR) によって定量されました。 周囲条件下では、この遺伝子は、有機炭素源での好気性増殖中（指数関数的増殖期の中間、gdwあたり平均2.9×107コピー）、生存中（定常期4日間、平均）よりも有意に高いレベル（P = 0.006）で発現しました。 . gdw あたり 1.5 × 106 コピー; P = 0.006) (図 5a、b)。 この発現パターンは、グループ 2a [NiFe]-ヒドロゲナーゼを保有する他の生物と類似しており9、典型的に飢餓によって誘導されるグループ 1h および 1l [NiFe]-ヒドロゲナーゼの発現パターンとは対照的です。 ヒドロゲナーゼの活性は、ガスクロマトグラフィーによって時間の経過に伴うヘッドスペース H2 混合比の減少を監視することにより、同じ 2 つの条件下で監視されました。 H2は、指数関数的に増殖する培養物によって30時間以内に大気圧以下の濃度まで急速に酸化されましたが、定常期培養物では無視できるほどの消費が起こりました（図5c）。 まとめると、これらの発見は、S. alaskensis が利用可能な有機基質とともに溶存 H2 を同時に消費することにより、海水中で混合栄養的に増殖できることを示唆しています。 これらの発見は、グループ 2a [NiFe]-ヒドロゲナーゼを保有する他の生物で観察されたものと密接に一致しており、H2 がおそらく一部の海洋細菌の増殖をサポートしているという熱力学モデリング (図 4) からの推論を裏付けています。

最後に、タラ海洋データセットにおける微量ガス酸化遺伝子の存在量と発現の環境相関関係を調査しました（図6および補足表6）。 線形相関分析により、好気性 H2 取り込みヒドロゲナーゼ (R2 = 0.22、P < 0.0001) および CO デヒドロゲナーゼ (R2 = 0.72、P < 0.0001) をコードする遺伝子は両方とも深さとともに有意に増加することが確認されました (図 6)。中深層水からのメタゲノムの存在量が増加しました（図2）。 これは、エネルギー変換ロドプシン（R2 = 0.59、P < 0.0001）などの光合成に関与する遺伝子が深さとともに急激に減少することとは対照的です（図2および6）。 このパターンは、大西洋、インド洋、太平洋、南洋のどの場所でも一貫していました。 これらの発見は、光、ひいてはエネルギーの利用可能性が減少するにつれて、光合成（光従属栄養）よりも微量ガスを使用する細菌（石従属栄養）の方が選択的に有利であることを示唆しています。

a-c、この分析は、エネルギー変換ロドプシン (a)、CO デヒドロゲナーゼ (b)、および好気性 H2 取り込みヒドロゲナーゼ (c) について視覚化されています。 上部と中央のパネルは、それぞれメタゲノムとメタトランスクリプトームにおけるマーカー遺伝子の存在量を最もよく予測する環境変数のランダム フォレスト モデリングを示しています。 重要性のベンチマークに使用されるランダム化変数に加えて、各モデルの最も重要な変数の上位 10 個の相対重要度 (モデル精度の低下の尺度としての平均二乗誤差の増加率 (%IncMSE)) が表示されます。 下のパネルは、各遺伝子のメタゲノム存在量と水深の間の単純な線形相関を示しています。 各遺伝子について、ピアソンの R2 値は適合度を示し、P 値は各傾きがゼロから大きく逸脱していることを確認します。

ソースデータ

これらの推論は、共相関変数（補足図10）を考慮した後、ランダムフォレストモデリング（図6および補足図11および12）によって微妙に調整されました。 深さは、グループ1lおよび2a [NiFe]-ヒドロゲナーゼ、COデヒドロゲナーゼ、およびエネルギー変換ロドプシンの存在量の上位3つの最も強力な予測因子の1つでした（図6および補足図11）。 緯度は、グループ1l [NiFe]-ヒドロゲナーゼおよびCOデヒドロゲナーゼの発現の強力な予測因子であることが証明され、後者は熱帯でピークに達します（図6および補足図11〜13）。 後者についての 1 つの説明は、熱帯海域では光化学的および熱化学的な CO 生成の増加により、CO 酸化剤に対する基質の利用可能性が高まるというものです。 これらの観察は、ムニダトランセクト全体で観察されたCOとH2の逆酸化速度（図1）、および以前に報告されたこれらのガスの海水濃度の緯度変化と一致しています23、24、25、26、27、28。 対照的に、グループ1d [NiFe]-ヒドロゲナーゼ遺伝子の存在量と発現レベルは、低酸素水中で最も高かった（図6および補足図14）。 これは、高親和性の酸素非感受性の対応物とは対照的に、このヒドロゲナーゼは、低酸素発酵によりH2レベルが上昇したときに最も転写され（その結果、感覚ヒドロゲナーゼが活性化される）、O2レベルが十分に低いときに最も活性が高いことを示唆しています。活性部位阻害38,51。 まとめると、我々の分析は、海洋微量ガス酸化剤の存在量と活性には複雑な環境制御があること、および 3 つの H2 取り込みヒドロゲナーゼが生態生理学的に異なることを示唆しています。

統合的なアプローチを通じて、我々は、H2 が海水コミュニティにとって重要なエネルギー源であることをおそらく初めて実証しました。 生物地球化学、メタゲノムおよび熱力学モデリング解析を総合すると、H2 は多様ではあるが少数の群落メンバーによって酸化されるが、岩石栄養成長を可能にする十分に速い細胞特異的な速度で酸化されることが示唆されています。 これらの発見は、超微小細菌 S. alaskensis が従属栄養増殖中に H2 を消費するという実験的観察によって裏付けられています。 H2 を酸化する能力を持つ海洋バクテリアは、おそらくこの豊富で拡散性の高い高エネルギーガスを消費できることから、大きな競争上の優位性を獲得していると考えられます。 H2 酸化海洋微生物は世界中に分布していますが、活性の測定とヒドロゲナーゼの分布プロファイルから、その活性には複雑な制御があり、特にクロロフィルの少ない海域で活性が高い可能性があることが示唆されています。 対照的に、我々の調査結果は、特にクロロフィルの多い水域では、CO 酸化が柔軟性を高め、主に生息地ジェネラリストの生存を促進する広範な特性であることを裏付けています 30,31。 生物地球化学的スケールでは、我々の研究結果は、海洋細菌が大気中の H2 排出を緩和し 19、南極海域の H2 飽和不足の原因となる可能性があることを示しています 28。

しかし、大きな謎が残っている。 H2 と CO は、比較的高い濃度とエネルギー収量を考慮すると、海で最も信頼できるエネルギー源の 1 つです。 では、なぜ比較的少数の細菌がそれらを利用するのでしょうか? 比較すると、存在する多数の細菌がこれらの微量ガスを急速に消費することを考えると、土壌はこれらの微量ガスの正味の吸収源となります12。 私たちは、これらの微量ガスを利用する金属酵素を作るために必要な資源投資が、得られるエネルギーによって必ずしも正当化されるわけではないかもしれないという単純な説明を提案します。 鉄が著しく制限されている海洋では、ヒドロゲナーゼ (プロトマーあたり 12 ～ 13 個の Fe 原子を含む 11) と、程度は低いものの CO デヒドロゲナーゼ (プロトマーあたり 4 個の Fe 原子を含む 63) が主要な投資となっています。 このトレードオフは、エネルギーを変換するロドプシンを通じて最小限の資源を使用して太陽エネルギーを収集できる表層海洋で最も顕著であると考えられます。 しかし、H2 と CO を消費するために必要な鉄への投資は、エネルギーが限られた深海や一次生産量が少ない地域や季節では正当化される可能性があります。 これは、中深層水のメタゲノムで観察されたヒドロゲナーゼおよびCO デヒドロゲナーゼの濃縮、および亜南極水で観察された H2 酸化の増加と一致しています。 さらに、鉄の利用可能性は通常、深部の循環水や大陸棚の周囲（深層水の湧昇と陸地からの流入の両方のため）でより高く、そこでは高いヒドロゲナーゼの発現と活性が観察されます64。 したがって、海洋は、さまざまな海洋細菌にとって H2 と CO のエネルギー源が重要であるにもかかわらず、正味の H2 と CO の供給源であり続けます。

海洋微生物群集が微量ガスを酸化する能力を判断するために、合計 14 個の海洋表層水サンプルが 3 つの異なる場所から収集されました (補足図 1)。 2019 年 7 月 23 日、穏やかな天候の中、RV ポラリス II でムニダ微生物天文台時系列トランセクト (ニュージーランド、オタゴ)65 全体から 8 つのサンプルが収集されました。 この海洋トランセクトはニュージーランドのオタゴ沖から始まり、ネライト、亜熱帯、亜南極の海域を通って広がっています65。 タイアロア岬から約 15 km から 70 km の範囲で、東に移動する 8 つの等距離の観測点がサンプリングされました。 各ステーションでは、ニスキンボトルを使用して深さ 1 m で水を収集し、オートクレーブ処理した 1 リットルのボトル ​​2 つに保管しました。 1 つのボトルは DNA の濾過と抽出用に確保され、もう 1 つは小宇宙のインキュベーション実験に使用されました。 容器は塩分と温度の変化を測定して、各水塊の境界を決定しました（補足図2）。

また、2019年3月20日にカラムビーチ（オーストラリア、ビクトリア州）の温帯ポートフィリップ湾から4つのサンプルが収集され、2019年7月9日に熱帯ヘロン島（オーストラリア、クイーンズランド州）から2つのサンプルが収集されました。両方のサイトで、海岸近くの表面微層水と地表水のサンプルは潮下帯（水深約 1 m）で収集されました。 ポート・フィリップ湾では、パターソン川河口の東7.5kmと15kmの地点でも2つのサンプルが採取され、それぞれ「中間」と「中心」とラベル付けされた。 すべての場合において、滅菌ショットボトルを使用して深さ約 20 cm から 3 リットルの地表水サンプルを収集し、小宇宙のインキュベーションと DNA 抽出のために等分しました。 表面微小層サンプルは、表面積 1,800 cm2 の手動ガラスプレートサンプラーを使用して収集されました66。 150 ～ 155 回の浸漬で合計 520 ～ 580 ml が収集され、平均サンプリング厚さは 20 μm になりました。 表面微層サンプルについては、180 ml を小宇宙インキュベーション用に確保し、残りの容量を DNA 抽出に使用しました。 すべてのトランセクトから、DNA 抽出用に確保した各サンプルを 0.22 μm ポリカーボネートフィルターを使用して真空濾過し、抽出まで -80 °C で保存しました。

溶存ガスも各トランセクトでその場でサンプリングされ、CO と H2 の溶存濃度が測定されました。 気密チューブを使用して血清バイアル (160 ml) に海水を満たし、約 300 ml がオーバーフローするようにしました。 次いで、バイアルへのガスの導入を避けて、処理された実験室グレードのブチルゴム栓でバイアルを密封した。 2 本の気密シリンジを使用して 20 ml の液体を同時に除去することにより、超高純度 N2 ヘッドスペース (20 ml) をバイアルに導入しました。 次いで、バイアルを２分間激しく振盪した後、５分間平衡化して、溶解ガスがヘッドスペースに入るようにした。 次に、ヘッドスペースのうち 17 ml を、除去した液体をバイアルに戻すことによって N2 でフラッシュしたシリンジに収集し、2 ml をパージして活栓と針をフラッシュした後、残りの 15 ml を N2 でフラッシュして真空にしたシリコン容器に注入しました。 Exetainer67 を閉じて保管します。 エクセテナーはステンレス鋼のボルトと O リングで密封され、測定まで保管されました。 Exetainer 内の H2 および CO 濃度は、既知の濃度の標準的な CO および H2 ガス混合物に対して校正された、前述のとおり68、パルス放電ヘリウムイオン化検出器 (モデル TGA-6792-W-4U-2、Valco Instruments) を使用したガスクロマトグラフィーによって分析されました。 。

これらの海洋微生物群集が CO と H2 を酸化する能力を調べるために、海水サンプルを実験室条件下でこれらのガスとともにインキュベートし、ガスクロマトグラフィーを使用してそれらの濃度を経時的に測定しました。 各サンプルについて、海水をホイルで包んだ血清バイアル (ムニダ トランセクトおよびポート フィリップ湾では 120 ml バイアルに 60 ml の海水、ヘロン島では 160 ml バイアルに 80 ml の海水) に移し、処理済みの液体で密封した 3 つの小宇宙をセットアップしました。ラボグレードのブチルゴム栓67。 各サンプリング場所について、1 セットの 3 つ組もオートクレーブ処理し、対照として使用しました。 各バイアルの周囲空気ヘッドスペースに H2 と CO をスパイクして、初期ヘッドスペース混合比が 2 ppmv (ムニダ トランセクトおよびポート フィリップ湾) または 10 ppmv (ヘロン島) に達するようにしました。 小宇宙は、シェーカーテーブル上で 100 rpm で 20 °C で連続的に撹拌されました。ムニダ湾およびポートフィリップ湾のサンプルの場合、毎日 1 ml のサンプルがヘッドスペースから抽出され、その含有量は上記のようにガスクロマトグラフィーによって測定されました。 ヘロン島サンプルの場合、各時点で 6 ml のガスが抽出され、UHP-He でフラッシュされた 12 ml の従来型 Exetainers (2018) または事前に排気された 3 ml のシリコンシールされた Exetainers67 に保管されました。

平衡状態および 1 気圧における海水中の溶存ガスの濃度は、参考文献に記載されているように、混合電解質溶液の Sechenov 関係式に従って計算されました。 69:

ここで、kG,0 と kG はそれぞれ水と混合電解質溶液中のガスの溶解度 (または同等のヘンリーの法則定数) を示します。hi は溶存イオン i (m3 kmol−1) に固有の定数、hG はガス-特定のパラメータ (m3 kmol−1) および ci は溶液中の溶存イオン i の濃度 (kmol m−3) を表します。 温度 T (K) におけるガス固有の定数 hG は次の方程式に従います。

ここで、hG,0 は 298.15 K での hG の値を表し、hT は温度効果のガス固有のパラメーター (m3 kmol−1 K−1) です。 温度 T におけるガス溶解度パラメーター kG,0 は、ヘンリーの法則とファント ホフ方程式を組み合わせたものに従います。

ここで、 \(k_{G,0}^\prime\) は 298.15 K におけるガスのヘンリーの法則定数を表し、 \({\Delta}_{\mathrm{soln}}H\) は溶液のエンタルピー、R は次のようになります。理想気体の法則定数。

1気圧および20℃のインキュベーション温度でヘッドスペース気相と平衡にある溶存ガスの濃度は、参考文献に報告されている平均海水組成に基づいて計算されました。 70. 塩分補正定数 hi、hG,0 および hT は参考文献から採用されました。 69、一方、温度補正定数 \(k_{G,0}^\prime\) と \({\textstyle{{ - {\Delta}_{\mathrm{soln}}H} \over R}}\)参照から得られました。 71.

速度論的分析では、最大 30 日間のインキュベーション時間の測定時点を使用しました。 ガス消費パターンは、指数モデルと線形モデルの両方に適合しました。 前者は、H2 消費量と CO 消費量の両方について、全体的な赤池情報基準値が最も低いことを示しました (補足表 1)。 したがって、一次反応速度定数が計算され、速度論的モデリングに使用されました。 さらに、正の速度定数を持つ少なくとも 2 つの反復を含むサンプルのみが、ガス消費量に自信があるとみなされました。 各サンプルのバルク大気ガス酸化速度は、対応する微量ガスの平均大気混合比 (H2: 0.53 ppmv; CO: 0.09 ppmv; CH4: 1.9 ppmv) に対して計算されました。 細胞固有のガス酸化速度を推定するために、ポート フィリップ湾センター 72 およびムニダ トランセクトに沿った 8 つの観測点の表層海水について報告された平均直接細胞数値を使用しました 65,73。 すべての細胞が生存可能で活動していると仮定して、メタゲノムショートリードから得られる微量ガス酸化剤の相対存在量の推定値（生物あたり 1 コピーと仮定した平均遺伝子コピー数。「代謝」を参照）を乗じることにより、細胞固有のガス酸化速度を推測しました注釈') をセル数によって調べて、微量ガス酸化剤の数を取得します。

対応する海洋微量ガス酸化剤に対する H2 および CO の酸化のエネルギー的寄与を推定するために、熱力学モデリングを実行し、上で推定した各サンプルの一次反応速度に従ってそれぞれの理論的エネルギー収量を計算しました。 電力 (セルごとの単位時間あたりのギブズ エネルギー) P は次の方程式に従います。

ここで、v は海水 1 リットルあたりの基質消費率 (mol l−1 s−1)、B は反応 H2 + 0.5 O2 → H2O (二水素酸化) および CO を実行する微生物細胞数 (細胞 l−1) を示します。 + 0.5 O2 → CO2 (一酸化炭素の酸化)。 ΔGr は、実験条件 (J mol−1) での反応のギブズ自由エネルギーを表し、次の方程式に従います。

ここで、\({\Delta}G_{\mathrm{r}}^0\) は反応の標準ギブズ自由エネルギー、Qr は反応商、R は理想気体定数、T は温度 (ケルビン) を表します。 水素酸化と一酸化炭素酸化の \({\Delta}G_{\mathrm{r}}^0\) の値は参考文献から得られました。 74. 各反応の Qr 値は、以下を使用して計算されました。

ここで、ag と ni はそれぞれ、海水中の i 番目の種の溶解濃度と、対象の反応における i 番目の種の化学量論係数を示します。 ギブスの自由エネルギーは、大気圧および 20 °C のインキュベーション温度での水素と一酸化炭素の酸化に対して計算されました。 報告されている細胞エネルギー要件に関連してH2およびCO酸化からの細胞出力収量を文脈化するために、参考文献1で報告されている20℃での121の有機従属栄養細菌の維持（内因性速度）および増殖（活性速度）電力要件の包括的なリストが報告されています。 53を一次参照として使用しました。 細胞当たりの維持エネルギー中央値 1.9 × 10−15 W は、上記参考文献の裏付け情報 sd01 で得られた細菌の内因性速度から導出されました。

メーカーの指示に従って、DNeasy PowerSoil キット (QIAGEN) を使用してサンプルフィルターから DNA を抽出しました。 抽出ブランクコントロールを含むサンプルライブラリーは、Nextera XT DNA サンプル調製キット (Illumina) を使用して調製され、オーストラリアエコゲノミクスセンター (クイーンズランド大学) の Illumina NextSeq500 プラットフォーム (2 × 151 bp) で配列決定されました。 サンプルあたり平均 20,122,526 リードペアが生成され、ネガティブコントロールでは 827,868 リードペアが配列されました (補足表 2)。 生のメタゲノム データは、BBTools スイート v38.90 (https://sourceforge.net/projects/bbmap/) で品質管理され、BBDuk を使用して 151 番目の塩基を削除し、アダプターをトリミングし、PhiX リードをフィルターし、3' 末端をトリミングしました。品質閾値は 15、長さ 50 bp 未満のリードは破棄します。 抽出ブランクで検出されたリードは BBMap v38.90 でさらに削除され、生のサンプルリードの合計 97.7% がさらなる分析のために残されました。 分類は、PhyloFlash v3.4 を使用して 16S rRNA および 18S rRNA 遺伝子を組み立てて分類することにより、高品質のショートリードからプロファイリングされました (参考文献 75)。 ショートリードは、metaSPAdes v3.14.1 (参考文献 76) で個別に収集され、MEGAHIT v1.2.9 (参考文献 77) で集合的に (すべてのサンプルをまとめて、場所ごとに) 収集されました。 各コンティグのカバレッジプロファイルは、BBMap v38.90 (参考文献 78) を使用してショートリードをアセンブリにマッピングすることによって生成されました。

ゲノムビニングは、長さ 2,000 bp 以上のコンティグのみを保持するように各ツールを設定した後、MetaBAT2 v2.15.5 (参考文献 79)、MaxBin 2 v2.2.7 (参考文献 80)、および CONCOCT v1.1.0 (参考文献 81) を使用して実行されました。 各アセンブリについて、結果として得られるビンは、DAS_Tool v1.1.3 (参照 82) を使用してビニング ツール間で複製解除されました。 すべてのビンは RefineM v0.1.2 (参考文献 83) で精製され、dRep v3.2.2 (参考文献 84) を使用してデフォルトの 99% 平均ヌクレオチド同一性で非重複メタゲノム構築ゲノム (MAG) の最終セットに統合されました。 。 各 MAG の完全性、汚染、および株の不均一性は CheckM v1.1.3 (参考文献 85) で計算され、合計 21 個の高品質 (>90% の完全性、<5% の汚染 86) と 89 個の中品質 (>完全性 50%、汚染度 10% 未満 86) MAG。 GTDB-Tk v1.6.0 (参考文献 87) (GTDB リリース 202 を使用) 88 を使用して分類法を各 MAG に割り当て、各 MAG から、さらに Prodigal v2.6.3 (参考文献89）。 CoverM v0.6.1 (https://github.com/wwood/CoverM) の「ゲノム」を使用して、各サンプルの各 MAG の相対存在量を計算しました (–min-read-aligned-percent 0.75、–min-read-percent -identity 0.95、–min-covered-fraction 0）、およびデータセット全体の MAG ごとの平均読み取りカバレッジ（-m 平均、–min-covered-fraction 0）。

グローバルな比較のために、タラ オーシャンズのグローバル データセットの生のメタゲノム (PRJEB1787) およびメタトランスクリプトーム (PRJEB6608) データを欧州ヌクレオチド アーカイブからダウンロードしました 47,50。 さらに、1,888 個の細菌および古細菌の MAG が参考文献で生成されました。 90 個がダウンロードされました (https://www.genscope.cns.fr/tara/ 経由)。

この研究で生成されたメタゲノムとタラ オーシャンズ データセットからのメタゲノムの両方について、高品質のショート リードとアセンブリおよび MAG からの予測タンパク質に、DIAMOND v2.0.9 (–max-target-seqs 1、–max-hsps 1) を使用して代謝アノテーションが付けられました。 )91 は、50 個の代謝マーカータンパク質データベースのカスタム セットに対するアライメント用です。 マーカータンパク質 (https://doi.org/10.26180/c.5230745) は、好気性呼吸と嫌気性呼吸、有機化合物と無機化合物からのエネルギー保存、炭素固定、窒素固定、光合成の主要な経路をカバーしています4。 遺伝子ヒットは次のようにフィルタリングされました。アライメントは、長さが少なくとも 40 アミノ酸 (現在の研究からの 150 bp メタゲノム)、長さ 32 アミノ酸 (100 bp のタラのメタゲノムおよびメタトランスクリプトーム)、または少なくとも 80 アミノ酸のいずれかのみを保持するようにフィルタリングされました。 % クエリまたは 80% の対象範囲 (アセンブリおよび MAG からの予測タンパク質)。 アライメントは、タンパク質ごとの最小同一性スコアパーセントによってさらにフィルタリングされました。ショートリードの場合、これは 80% (PsaA)、75% (HbsT)、70% (PsbA、IsoA、AtpA、YgfK、および ARO)、60% (CoxL、 MmoA、AmoA、NxrA、RbcL、NuoF、FeFe ヒドロゲナーゼおよび NiFe グループ 4 ヒドロゲナーゼ) または 50% (他のすべての遺伝子)。 予測タンパク質については、AtpA (60%)、PsbA (60%)、RdhA (45%)、Cyc2 (35%)、および RHO (30%) を除き、同じ閾値を使用しました。

ショートリードの場合、コミュニティ内の遺伝子存在量は、遺伝子の存在量（100万キロベースあたりのリード数、RPKM）を14のユニバーサルシングルコピーリボソームマーカー遺伝子の平均存在量（ RPKM、SingleM v0.13.2 パッケージ (https://github.com/wwood/singlem) から取得。 単一コピーの代謝遺伝子の場合、これはその遺伝子をコードするコミュニティ メンバーの割合に対応します。 GraphPad Prism 9 で実行された線形相関分析を使用して、メタゲノム遺伝子の存在量が生息地外の H2 および CO 酸化速度とどのように相関するかを決定しました。 タラ オーシャンズ データセットの場合、メタトランスクリプトーム (RPKM) 内の遺伝子存在量を、対応するメタゲノム (RPKM) 内の遺伝子存在量で割ることによって RNA:DNA 比を計算し、存在量に対する遺伝子発現を調べました。 複製メタゲノムまたはメタトランスクリプトームが存在する場合、RPKM 値はサンプルごとに平均されました。

系統樹は、H2 および CO 酸化が可能な海洋微生物の分布と多様性を理解するために構築されました。 グループ 1 および 2 [NiFe]-ヒドロゲナーゼ、グループ 3 および 4 [NiFe]-ヒドロゲナーゼ、および I 型 CO デヒドロゲナーゼ (CoxL) の触媒サブユニットについてツリーを構築しました。 すべての場合において、相同性ベースの検索によって MAG から取得されたタンパク質配列は、MEGA11 の ClustalW を使用してカスタムタンパク質データベース 6,49 からの参照配列のサブセットに対してアラインメントされました (参考文献 92)。 簡単に言うと、進化的関係は最尤系統樹を構築することによって視覚化されました。 具体的には、ヒューリスティック検索の初期ツリーは、Jones-Taylor-Thornton (JTT) モデルを使用して推定されたペアごとの距離の行列に近隣結合および BioNJ アルゴリズムを適用し、MEGA11 内で優れた対数尤度値を持つトポロジを選択することによって自動的に取得されました。 。 すべての残基が使用され、ツリーは 50 回の複製でブートストラップされました。 系統樹の注釈付けと視覚化は、iTOL (v6.6) を使用して実行されました。

タラ海洋データセットに対してランダム フォレスト モデル、ピアソン相関およびスピアマン相関が生成され、サンプルの環境メタデータと一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ロドプシンおよび [NiFe] グループ 1d、1e、1l、2a、3b、および 3d の正規化された存在量との間の有意な相関関係が特定されました。ヒドロゲナーゼ遺伝子 (メタゲノムの場合は生物ごとのコピー数、メタトランスクリプトームの場合は log10(RPKM + 1) として示されます)。 環境変数が高度に相関していた共線性を説明するために（ピアソン係数 > |0.7|、補足図 10）、これらの特徴全体での変数の重要性の分割を避けるために、ランダム フォレスト モデルから 1 つが除外されました。 これらの除外変数は、深さとの相関が高い (保存された) 場合を除き、ランダムに選択されました。 次に、データが欠落している代入値 (関数 rfImpute()) を使用して、補足表 6 にマークされた環境変数を予測子 (重要度 = TRUE、ntree = 3,000) として使用し、R を使用して、上記の各遺伝子に対してランダム フォレスト モデルを生成しました。パッケージrandomForest93。 上記の遺伝子と環境変数のすべての組み合わせは、欠損値を省略し、誤発見率補正ですべての P 値を調整することにより、ピアソンおよびスピアマンの順位相関とさらに相関されました。

この研究では、3 つの細菌株の無菌培養物を分析しました。UNSW シドニーから入手した Sphingopyxis alaskensis (RB2256)56,57、DSMZ から輸入した Robiginitalea biformata DSM-15991 (参考文献 54)、および DSMZ から輸入した Marinovum algicola FF3 (Rhodobacteraceae)55 です。 培養物は、処理されたラボグレードのブチルゴム栓で密封された、周囲空気のヘッドスペース（H2混合比〜0.5 ppmv）を含む120 mlのガラス血清バイアル中で維持されました67。 3 種すべてのブロス培養物を 30 ml の Difco 2216 Marine Broth 培地で増殖させ、自然な昼夜サイクルにアクセスできる Ratek オービタル ミキサー インキュベーター内で 150 rpm の撹拌速度で 30 °C でインキュベートしました。 Eppendorf BioSpectrophotometerを使用して、定期的にサンプリングした1 ml抽出物の光学密度(OD600)を測定することによって増殖をモニタリングした。 3 つの培養物の H2 酸化能力をガスクロマトグラフィーで測定しました。 生物学的三連の培養物を開封し、周囲空気で平衡化し(1時間)、再度密封した。 次に、これらの再通気バイアルを H2 (N2 ガスシリンダー内の 1% v/v H2、純度 99.999%) で修正して、最終ヘッドスペース濃度を約 10 ppmv に達しました。 ヘッドスペース混合比は、密閉直後、およびその後ガスクロマトグラフの定量限界（42 ppbv H2）に達するまで一定の間隔で測定されました。 この分析は、指数関数的培養（S. alaskensis の OD600 0.67）と定常期培養（S. alaskensis の ODmax の約 72 時間後）の両方に対して実行されました。

定量的逆転写 PCR (RT-qPCR) を使用して、S. alaskensis の増殖および生存中のグループ 2a [NiFe]-ヒドロゲナーゼ大サブユニット遺伝子 (hucL; 遺伝子座 Sala_3198) の発現レベルを決定しました。 RNA抽出のために、S. alaskensisの３０ml培養物を１２０ml密閉血清バイアル内で同時に増殖させた。 培養物を対数期（OD600 0.67）または定常期（ODmax から 48 時間後～3.2）まで増殖させました。 次に、グリセロール生理食塩水 (-20 °C、3:2 v/v) を使用して細胞をクエンチし、遠心分離 (20,000 × g、30 分、-9 °C) によって収集し、1 ml の冷 1:1 グリセロールに再懸濁しました。 ：生理食塩水（−20℃）に加え、さらに遠心分離した（20,000×g、30分、−9℃）。 簡単に説明すると、得られた細胞ペレットを 1 ml TRIzol 試薬 (Thermo Fisher) に再懸濁し、0.1 mm ジルコンビーズ (0.3 g) と混合し、Precellys 24 でビーズビーティング (30 秒オン/30 秒オフのサイクルを 3 回、5,000 rpm) に供しました。ホモジナイザー (Bertin Technologies) で遠心分離 (12,000 × g、10 分、4 °C) します。 メーカーの指示 (TRIzol 試薬ユーザーガイド、Thermo Fisher) に従ってフェノール-クロロホルム法を使用して全 RNA を抽出し、ジエチルピロカーボネート処理水に再懸濁しました。 ＲＮＡは、ＴＵＲＢＯ ＤＮＡフリーキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を製造業者の指示に従って使用して処理した。 RNA の濃度と純度は、NanoDrop ND-1000 分光光度計を使用して確認しました。

相補 DNA は、メーカーの指示に従って、ランダム ヘキサマー プライマーを使用した RT-qPCR 用 SuperScript III First-Strand Synthesis System キット (Thermo Fisher) を使用して合成しました。 RT-qPCR は、QuantStudio 7 Flex リアルタイム PCR システム (Applied Biosystems) で、メーカーの説明書に従って 96 ウェル プレート内の LightCycle 480 SYBR Green I Master Mix (Roche) を使用して実行されました。 プライマーは、hucL 遺伝子 (HucL_fw: AGCTACACAAACCCTCGACA; HucL_rvs: AGTCGATCATGAACAGGCCA) およびハウスキーピング遺伝子として 16S rRNA 遺伝子 (16S_fwd: AACCCTCATCCCTAGTTGCC; 16S_rvs: GGTTAGAGCATTGCCTTCGG) を標的とするように、Primer3 (参考文献 94) を使用して設計されました。 各遺伝子のコピー数は、108 コピーから 10 コピーまで連続希釈したアンプリコンの閾値サイクル (CT) 値から作成された各遺伝子の標準曲線から補間されました (R2 > 0.98)。 次いで、ヒドロゲナーゼ発現データを指数関数期のハウスキーピング遺伝子に対して正規化した。 すべての生物学的三連サンプル、標準およびネガティブコントロールは技術的に二連で実行されました。 GraphPad Prism 9 の Student の t 検定を使用して、指数関数的期と定常期の間の hucL 発現レベルを比較しました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

すべての生のメタゲノムおよびメタゲノムで組み立てられたゲノムは、BioProject アクセッション番号 PRJNA801081 で NCBI Sequence Read Archive に寄託されています。 タラ オーシャンズのグローバル データセットからの生のメタゲノム (PRJEB1787) およびメタトランスクリプトーム (PRJEB6608) データは、欧州ヌクレオチド アーカイブ (https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB402) からダウンロードされました。 参考文献で生成された細菌および古細菌の MAG (1,888)。 90 は https://www.genscope.cns.fr/tara/ からダウンロードされました。 この研究で使用した代謝マーカータンパク質データベースには、参照ヒドロゲナーゼ配列と一酸化炭素デヒドロゲナーゼ配列が含まれており、https://bridges.monash.edu/collections/_/5230745 から入手できます。

メタゲノミクス分析スクリプトは、https://github.com/greeninglab/MarineOxidationManuscript で公開されています。

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この研究は、ARC Discovery Project 助成金（DP180101762 および DP210101595 はいずれも PLMC と CG に授与され、DP150100244 は RC に授与）、ARC DECRA フェローシップ（DE170100310; CG の給与）、NHMRC EL2 フェローシップ（APP1178715; CG の給与）、オーストラリア政府研究訓練奨学金 (PML に授与)、モナシュ国際授業料奨学金 (PML および Y.-JC に授与)、およびモナシュ大学院出版賞 (ZFI および Y.-JC に授与)。

これらの著者は同様に貢献しました: Rachael Lappan、Guy Shelley、Zahra F. Islam。

モナシュ大学生物医学発見研究所微生物学部、メルボルン、ビクトリア州、オーストラリア

レイチェル・ラッパン、ザーラ・F・イスラム、ポク・マン・レオン、タナビット・ジラパンジャワット、ガオフェン・ニー、ヤージュー・チェン、クリス・グリーニング

モナシュ大学生物科学部、メルボルン、ビクトリア州、オーストラリア

ガイ・シェリー、ヤジュー・チェン、クリス・グリーニング

オタゴ大学、ダニーデン、ニュージーランドの微生物学および免疫学部

スコット・ロックウッド & セルジオ・E・モラレス

モナッシュ大学化学学部、メルボルン、ビクトリア州、オーストラリア

フィリップ・A・ナウアー & ペラン・LM・クック

Center to Impact AMR、モナシュ大学、メルボルン、ビクトリア州、オーストラリア

タナビット ジラパンジャワット & クリス グリーニング

モナシュ大学地球・大気・環境学部、メルボルン、ビクトリア州、オーストラリア

アダム・J・ケスラー

バイオテクノロジーおよび生体分子科学学部、UNSW シドニー、シドニー、ニューサウスウェールズ州、オーストラリア

ティモシー・J・ウィリアムズ & リカルド・カヴィッキオーリ

ウィーン大学、機能進化生態学部、真菌および生物地球化学海洋学、ウィーン、オーストリア

フェデリコ・バルタール

SAEF: Securing Antarctica's Environmental Future、モナッシュ大学、メルボルン、ビクトリア州、オーストラリア

クリス・グリーニング

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CG がこの研究を考案し、監修しました。 CG、GS、SEM、PLMC、RL、ZFI が実験を設計しました。 GS、SL、SEM、PAN、Y.-JC、AJK、PLMC がフィールドワークに貢献しました。 RL、GS、SL、CG はメタゲノム解析に貢献しました。 CG と GN は系統解析に貢献しました。 GS、PML、PAN、CG は生物地球化学分析に貢献しました。 PML、CG、FB、PMLC は熱力学モデリングに貢献しました。 ZFI、TJ、GS、TJW、RC、CG は文化に基づいた研究に貢献しました。 RL と CG は環境要因分析に貢献しました。 CG、RL、ZFI は、すべての著者からの意見をもとにこの論文を執筆しました。

クリス・グリーニングへの通信。

著者は利益相反がないことを宣言します。

Nature Microbiology は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

補足図。 1 ～ 14 および補足表 1 ～ 6 の凡例。

補足表 1 ～ 6 を含む Excel ワークブック。そのほとんどは複数のタブで構成されています。 テーブル番号は、各スプレッドシートの最初の行とタブ名で指定されます。

図 1 の元データ。

図 2 の元データ。

図 3 の元データ。

図4のソースデータ。

図5のソースデータ。

図6のソースデータ。

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ラッパン、R.、シェリー、G.、イスラム、ZF 他。 海水中の水素分子は、多様な海洋細菌の増殖をサポートします。 Nat Microbiol 8、581–595 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41564-023-01322-0

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受信日: 2022 年 8 月 26 日

受理日: 2023 年 1 月 5 日

公開日: 2023 年 2 月 6 日

発行日：2023年4月

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