アンモニアとメラニン生成の相互調節はクリプトコッカスの毒性に影響を与える

Nature Communications volume 14、記事番号: 849 (2023) この記事を引用

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真菌クリプトコッカス・ネオフォルマンスはクリプトコッカス症の原因物質であり、この病気は抗真菌薬で治療しなければ一様に致死的であるが、現在の治療法は宿主毒性と病原体耐性によって妨げられている。 この致命的な病気と戦うための魅力的な代替アプローチは、病原体由来の毒性メカニズムを直接標的にすることです。 C. neoformans は、分離された実体として以前に研究されている複数の病原性因子を発現します。 これらの中には、ファゴソームの pH を上昇させ脳浸潤を促進するウレアーゼや、免疫細胞や抗真菌治療から保護するメラニン化が含まれます。 今回我々は、これら 2 つの病原性因子間の相互依存関係を報告します。 尿素を加水分解する細胞はアンモニアガスを放出します。アンモニアガスは離れた場所で作用してpHを上昇させ、近くの細胞のメラニン化速度を高めます。これにより、ウレアーゼを運ぶ細胞外小胞の分泌が減少します。 この相互関係は、医薬品開発において単離された毒性メカニズムを標的とすることがなぜ困難であるかを説明する可能性のある新たな特性として現れ、複合的な毒性を考慮するより総合的なアプローチの必要性を主張します。

病原性因子とは、感染した微生物に損傷を与え、免疫応答にもかかわらず感染した宿主に存続する能力を与える形質です1。 病原体は、表面コーティング、毒素、酵素など複数の病原性因子を利用する傾向がありますが、ほとんどの研究は、病原性複合体への寄与を考慮せず、単一因子の病原性への独立した寄与に焦点を当てています2。 病原性因子が相互作用するメカニズムは、微生物の病因において比較的未解明のテーマです。

C. neoformans は、多糖類莢膜、メラニン生成、ウレアーゼやホスホリパーゼなどのさまざまな酵素の発現など、一連の多様な病原性因子を発現します。 多糖類のカプセルとメラニン色素は、それぞれ食作用と食細胞の酸化バーストから保護します3,4。 ウレアーゼは栄養酵素であり、尿素を加水分解してアンモニアを生成することでファゴソームの酸性化を偶発的に妨げ5、脳浸潤に重要な役割を果たします6,7。一方、ホスホリパーゼはマクロファージのファゴソーム膜に損傷を与え、細胞内生存を促進します8。 これらの病原性因子がどのように相互作用するかについてはほとんど情報がありません。

この研究は、クリプトコッカスウレアーゼ活性とメラニン化の間の相互作用を特徴付けています。 ウレアーゼは細胞外小胞内で放出され、尿素を加水分解してアンモニアを生成します。アンモニアは、気体として移動する能力により遠隔地での作用を媒介することがここで示されています。 メラニン化反応は pH に依存するため、ウレアーゼによるアンモニアの生成増加によって促進されます。 メラニン化の強化は、ファゴソーム内でのクリプトコッカス細胞の存続を促進し、それによってトロイの木馬機構を介して脳への播種を増加させることが判明した。 細胞壁におけるメラニンの沈着は、細胞外小胞の生成を減少させて小胞関連ウレアーゼの放出を阻害することにより、フィードバック機構として機能します。 したがって、ウレアーゼとメラニンは、感染のさまざまな段階で利点を提供する相互調節を示し、病原性因子のこの調整と相乗効果により、各成分を単独で研究した場合には予​​想できなかった表現型の変化がもたらされます。

急速尿素ブロス9でC.ネオフォルマンスのウレアーゼ活性をアッセイしているときに、インキュベーション時間が延長されると、無細胞ウェル内の培地のpHも上昇することに気づきました（図1a、左パネル）。 各ウェルの 560 nm での吸光度 (A560) を測定すると、無細胞ウェルの色の変化と隣接するウェルの細胞数の間に直接的な直線関係があることが明らかになりました (図 1a、右パネル)。 この現象がウレアーゼ活性に依存しているかどうかを確認するために、野生型 (WT) 細胞またはウレアーゼ欠損 (ure1Δ) 細胞を、24 ウェル プレートの 1 つのウェルの尿素ブロスで、残りのウェルの無細胞培地で増殖させました。 23の井戸。 30℃で24時間インキュベートした後、WT細胞を含むウェルと周囲のいくつかのウェルの培地の色が黄色からピンク色に変化しましたが、ure1Δ細胞を含むプレートでは色の変化は観察されませんでした（図1b、左パネル）。 無細胞培地のA560とアンモニアを産生するWT細胞までの距離との間のシグモイド関係（図1b、右パネル）は、中点がpKaであるpH滴定曲線に似ていました。 データのボルツマン曲線フィットにより、中間値は 56 mm となり、この距離内の 8 つのウェル内の培地の pH が、尿素ブロス中のフェノールレッドの pKa である少なくとも 7.9 まで上昇したことが示唆されます。 0 ～ 200 ppm の範囲の手持ち式アンモニア ガス検出器を使用すると、最小開始細胞密度 2 × 106 細胞/mL で 30 °C、尿素ブロスで 24 時間増殖させた培養物の 30 秒間の読み取り中にアンモニアが検出可能でした。尿素濃度が 2% で一定に保たれた場合 (図 1c、左パネル)、または最小尿素濃度が 0.25% で細胞密度が 1 × 108 細胞/mL で一定に保たれた場合 (図 1c、右パネル)。 どちらの場合も、細胞密度と尿素濃度がさらに低くても培地のpHが上昇したことから分かるように、24時間の間に生成されたアンモニアの累積量はかなり高かった（図1c）。

a 30℃で2時間または6時間インキュベートした後の、示された数のC.ネオフォルマンス細胞を含む尿素ブロスを含むウェル、または細胞を含まないウェルのカラー写真（左パネル）。 6 時間後の無細胞培地の 560 nm での吸光度 (A560) は、隣接するウェル内の細胞数の増加に伴って直線的に増加を示します (右パネル)。 b すべてのウェルに尿素ブロスを含み、左上のウェル（A1）に1×108個の野生型（WT）またはure1Δ細胞を含むプレートを30°Cで24時間後に撮影した（左パネル）。 A560 とウェル A1 への近接性との間のシグモイド関係 (右パネル) は WT で観察されますが、ウレアーゼ欠損細胞では観察されません。 c 開始細胞密度を増加させながら（左パネル）、または尿素濃度を増加させながら（右パネル）、30°Cの尿素ブロス中で24時間増殖させたWT培養物について測定した、培養上清（ピンク）およびアンモニアガス（NH3、黒）の最大A560パーセント。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

次に、C.ネオフォルマンスの細胞から放出されたアンモニアが近くの細胞にどのような影響を与えるかを調査しました。 ドーパミンの化学酸化はアルカリ性 pH10 でより容易に起こるため、アンモニア生成による pH の上昇がメラニン形成を促進する可能性があると仮定しました。 実際、尿素ブロス中のure1Δ細胞と比較して、WT付近のドーパミンを添加した寒天上で増殖する細胞は、アンモニア源に近づくにつれて直線的に増加するより多くのメラニン色素産生を示しました（図2a）。 C. neoformans は酸性 pH11 で最もよく増殖するため、メラニン化は pH 5.5 の最少培地で日常的にアッセイされます。 ドーパミンを添加した寒天の pH を pH 5.5 から 7 まで滴定すると、色素生成は pH 6 から 6.5 および pH 6.5 から 7 で大幅に増加しました (図 2b)。 これは、アンモニア産生細胞の近くで増殖する細胞で観察されたメラニン化の増加が、ドーパミン寒天の pH 上昇の結果であることを示唆しています。 尿素ブロスで増殖する WT 細胞によるアンモニア生成は、pH 5.5 のドーパミン寒天上で増殖する近くの細胞のメラニン化を刺激しましたが、培地を pH 7 に事前調整すると、WT、ure1Δ、および無細胞コントロール プレートで同等のレベルの色素沈着が得られました (図.2c、左パネル）。 30℃で48時間後、ドーパミン寒天のpHは、尿素ブロス中のWT細胞を含むプレートでのみ大幅に増加しましたが、ure1Δを含むプレートまたは無細胞コントロールでは増加しませんでした（図2c、右パネル）。 また、近くのウェルでのC.ネオフォルマンスの増殖に対するアンモニア放出の影響を調べたところ、アンモニア源に近づくにつれて培地のpHが比例して増加し、pHが8.5以上に増加すると増殖が損なわれることがわかりました（図2d）。

a WT C. neoformans 細胞を、尿素ブロス中の WT または ure1Δ 細胞の存在下、0.1 (緑色) または 1 mM (オレンジ) のドーパミン (DA) を補充した寒天上で 30 °C で 24 時間メラニン化させました (左パネル)。 3 つの生物学的複製の定量化された色素沈着により、ウレアーゼ欠損変異体と比較して、アンモニア産生 WT 細胞への接近が増加するにつれてメラニン化が線形に正味増加することが明らかになりました (右パネル)。 b 1 mM DAを添加した寒天上で30℃で48時間メラニン化したWT細胞は、pH 6.5および7.0で色素沈着の有意な増加を示します。 n = 4、NS は有意ではない、****p < 0.0001; Tukey の多重比較検定を使用した一元配置分散分析。 c WTまたはure1Δを含むウェルに隣接して1 mM DAを補充したpH 5.5または7.0寒天上で30℃で48時間WT C.ネオフォルマンスを増殖させた後の定量化された色素沈着（左パネル）および寒天のpH（右パネル）（ mut) 尿素ブロスまたは無細胞培地 (neg) 内の細胞。 n = 4、NS は有意ではない、****p < 0.0001; Tukey の多重比較検定を使用した一元配置分散分析。 d 尿素ブロス中で細胞から指定された距離で増殖する細胞の増殖曲線。 グラフは、3 つの生物学的複製の平均 ± 標準偏差です。 実験終了時に測定された培養上清の pH が示されています。 e 尿素ブロス中のWTまたはure1∆細胞の近くで1 mM DAを添加した寒天上で増殖させたWT、lac1∆、またはlac2∆細胞の代表的な画像（上のパネル）。 グラフは、WT プレートの対応するウェルの測定値から ure1Δ プレートの各ウェルの測定値を差し引くことによって計算された色素沈着の純増加です (下のパネル)。 n = 4、NS は有意ではない、****p < 0.0001; Tukey の多重比較検定を使用した一元配置分散分析。 f 尿素ブロス中のWT細胞を含む24ウェルプレートの列2〜6で30℃で24時間インキュベートした後のGFP-ラッカーゼ1を発現する細胞の蛍光（GFP）および明視野（BF）画像（上のパネル）。列 1 (スケール バー = 5 μm)。 培養上清の pH は、アンモニアを生成する細胞に近づくにつれて上昇し (左下のパネル、3 つの生物学的複製の平均 ± 標準偏差としてグラフ化)、GFP 蛍光レベルはアンモニア源に最も近い 2 つのカラムで有意に高かった (右下のパネル)。 n = 3、NS は有意ではない、*p = 0.0154、**p = 0.0046; Tukey の多重比較検定を使用した一元配置分散分析。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

アンモニアに反応して生じる色素沈着の増加が実際にC.ネオフォルマンスによるメラニン生成に起因するのか、それとも単にアルカリ性pH10によっても促進されるドーパミンの自己重合の増加に起因するのかを確認するために、我々は分析をメラニン生成に欠陥のある変異株を含めて拡張した。 グルコース飢餓に応答して、C. neoformans は 2 つのラッカーゼ遺伝子、LAC1 を発現します。LAC1 は主要なラッカーゼ遺伝子であり、その欠失によりアルビノ表現型が生じます 12。もう 1 つは、より低いレベルで発現され、削除された場合の軽度のメラニン化欠陥13。 我々は、尿素ブロス中のWTまたはure1Δ細胞の存在下で、DAを添加した寒天上でWT、lac1Δおよびlac2Δ細胞のメラニン化についてアッセイしたところ、アンモニアを介した色素産生の刺激は、lac1Δでは無効化されるが、lac2Δでは無効化されないことが判明した(図2e)。 したがって、C. neoformans におけるメラニン化の原因となる主要なラッカーゼ 1 は、拡散性アンモニアに関連するメラニン化効果にも関与しています。

ラッカーゼ 1 によって触媒されるメラニン化はウレアーゼによって生成されるアンモニアによって特異的に刺激されるため、我々はラッカーゼ 1 の発現と細胞局在に対するアンモニアガスの影響の調査を続けました。 アミノ末端GFP-ラッカーゼ1融合タンパク質の発現により、この酵素は酸性pHでは細胞質小胞に誤って局在し、生理的pH14では細胞壁に輸送されることが明らかになった。 我々は、尿素ブロス中のWT細胞を添加したウェルの最初の垂直列を除く、24ウェルプレートのすべてのウェルでGFPラッカーゼ1発現株を増殖させた。 30 °C で 24 時間インキュベートした後、生細胞の蛍光顕微鏡により GFP ラッカーゼ 1 の細胞局在を視覚化しました。 拡散性アンモニア源に近づくにつれて、GFP-ラッカーゼ 1 はますます細胞壁を標的とするようになり (図 2f、上のパネル)、これは培地の pH の上昇と相関しました (図 2f、左下のパネル)。 GFP蛍光の分光光度測定により、アンモニア源に最も近いウェル内の細胞は、より離れた細胞よりも有意に多くの蛍光を発していることが明らかになりました（図2f、右下のパネル）。文化メディア。

ウレアーゼ活性によって生成されたアンモニアはメラニン化を促進しましたが、メラニン化はウレアーゼ活性を劇的に減少させました（図3a）。 メラニン化は細胞へのリポソームの取り込みを妨げます15。そして我々は、メラニン化細胞壁が同様に細胞外小胞の放出に対する障壁を与えることを発見しました。これは、メラニン化されていない細胞と比較してメラニン化細胞の培養上清中の親油性プローブの蛍光が低いことから証明されています（図1）。 3b)。 小胞輸送に対するメラニン化の影響をより直接的に調べるために、固体培地で増殖させた細胞から細胞外小胞を単離するために最近最適化された方法を採用し、非メラニン化細胞とメラニン化細胞からの収量を比較しました。 脂質含有量とウレアーゼ活性の両方は、最少培地のみと比較して、1 mMドーパミンを補充した寒天上で増殖させた同等の数のWT細胞からの小胞調製物の方が有意に低かった（図3c）。 メラニン色素を産生できないlac1Δ株の場合、細胞外小胞収量とウレアーゼ活性は、ドーパミンの非存在下または存在下で増殖させた細胞と同等でした（図3c）。 したがって、クリプトコッカスの細胞壁のメラニンは細胞からの小胞輸送を妨げ、ウレアーゼ活性が低下します。これは、ウレアーゼが細胞外小胞で分泌される病原性因子の 1 つであるためです 17。 非メラニン化細胞と比較してメラニン化細胞のウレアーゼ活性の低下は、放出されるアンモニア量の大幅な減少（図3d）と、メラニン化細胞が近くの細胞のメラニン化を刺激する能力（図3e）にも現れました。

a ウレアーゼブロス培養上清の A560 として測定した経時的なウレアーゼ活性は、メラニン化 (MEL) 細胞と比較して非メラニン化 (NM) 細胞で有意に高かった (左パネル; n = 3、**p = 0.0045、****p < 0.0001; Sidak の多重比較検定を使用した二元配置分散分析 (二元配置 ANOVA) は、統計的に同等の細胞密度を持つ 3 つの培養物について (右パネル; n = 3、NS は有意ではない; 対応のない両側パラメトリック t 検定)。 b 培養上清中の親油性プローブ、1,6-ジフェニル-1,3,5-ヘキサトリエン（DPH）の蛍光によって測定した、NM細胞と比較してMELからの細胞外小胞の放出の減少。 n = 5、****p < 0.0001; 対応のない両側パラメトリック t 検定。 c 最少培地（MM）またはドーパミン添加（DA）寒天プレート上で増殖させた同等の数の細胞（左パネル; n = 3、NSは有意ではない）から細胞外小胞を単離すると、脂質含有量が大幅に低下しました（中央パネル; n = 3） 、NS 有意なし、****p < 0.0001; 対応のない両側パラメトリック t 検定）およびウレアーゼ活性（右パネル; n = 3、NS 有意なし、**p = 0.0074; 対応のない両側パラメトリック t 検定） t 検定)、DA の存在下で増殖させた WT 細胞ではなく lac1Δ 細胞については検定しました。 d 24 ウェル プレート (左) の尿素ブロス中の NM または MEL 細胞をウェル A1 (左上) に入れ、残りのウェルに pH 感受性培地を入れ、30 °C で 24 時間インキュベートした後に写真を撮影。 ウェル A1 から 50 mm (円で囲まれた) 以内のウェルの A560 の散布図 (右) は、メラニン化細胞のアンモニア生成が大幅に減少していることを示しています。 n = 7、****p < 0.0001; 対応のない両側パラメトリック t 検定。 e WT細胞は、尿素ブロス中のNMまたはMEL WTまたはure1Δ細胞に隣接するウェル内の1 mM DA添加寒天上で30℃で18時間増殖させた（左パネル）。 色素沈着の純増加を定量化したグラフ (右) は、MEL WT 細胞と比較して、NM によるメラニン化の刺激が著しく大きいことを示しています。 n = 4、****p < 0.0001; 対応のない両側パラメトリック t 検定。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

感染時にウレアーゼによって生成されるアンモニアの影響を調べるために、マウスに約 5 × 105 個の WT 細胞または ure1Δ 細胞を鼻腔内吸入によって接種し、感染を 3 週間続行させました。 この時点で、WTに感染した動物は、健康そうに見えたure1Δ感染マウスと比較して、著しく瀕死の状態にあった。 肺内の真菌負荷を比較すると、WTのコロニー形成単位（CFU）の平均が6.1×108であることが明らかになり、これはure1Δで測定された平均の3.1×107よりも一桁以上大きかった（図4a）。 ure1Δ細胞に感染した10匹のマウスのうち2匹では、増殖性肺感染症が発症しなかったため、これらの動物はさらなる分析から除外された。 WT感染マウスから切除した肺は、ure1Δ感染マウスから回収した肺と比較して有意に大きかった（図4b）。 脳播種におけるウレアーゼ活性の役割と一致して6,7、ure1Δを鼻腔内に感染させたマウスの脳真菌負荷は肺よりも約4対数低かったのに対し、WT感染マウスのCFUは平均して約100倍しか低かった肺と比較した脳の場合（図4a）。

a 鼻腔内感染により、WT に感染したマウス (n = 10) の肺と脳の両方で、ure1Δ (n = 8、肺、n = 6、脳) と比較して有意に高い真菌負荷が生じました。 ****p < 0.0001; 対応のない両側パラメトリック t 検定。 b 肺質量も、ure1Δと比較して、WTを鼻腔内感染させたマウスの方が有意に高かった。 n = 10、WT; n = 8、ure1Δ、****p < 0.0001; 対応のない両側パラメトリック t 検定。 c 55 cm3の囲いに密閉されたWTまたはure1Δに感染したマウスの呼気中のアンモニアレベルを2分間測定した。 n = 7、***p = 0.0001; 対応のない両側パラメトリック t 検定。 d 解剖直後および組織の均質化および遠心分離後に MI-407 針電極を使用して測定した肺組織の pH は、ure1Δ と比較して WT に感染したマウスで有意に高かった（n = 10、WT; n = 8、ure1Δ、**）それぞれ、p = 0.0036 および *p = 0.0358)。 e WTまたはure1Δのいずれかに感染した3匹のマウスからのH＆E染色肺組織切片の代表的な画像（上のパネル）（青い矢印、スケールバー= 10μm）。 総数 (左下のパネル; n = 3、*p = 0.0316; 対応のない両側パラメトリック t 検定) およびパーセンテージ (右下のパネル; n = 3、*p = 0.0274; 対応のない両側) の定量化パラメトリック t 検定)、3 匹の感染動物の組織切片で検出された重度にメラニン化したクリプトコッカス細胞 (赤い矢印)。 f 均質化した組織を濃塩酸で煮沸した後、WT細胞またはure1∆細胞に感染したマウスの肺から単離されたメラニンに富む粒子の3つの独立した調製物からの代表的な明視野画像。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

我々は、ウレアーゼ陽性の C. neoformans が急性肺感染症中に検出可能なレベルのアンモニアを生成すると仮定しました。 感染動物を小さな気密容器に2分間閉じ込めることにより、アンモニアガスが検出されなかったure1Δ感染マウスと比較して、WT感染動物の呼気中のアンモニアガスの平均値は1.1±0.5ppmでした（図1）。 4c）。 比較として、2% 尿素の存在下で増殖する 2 × 106 個の C. neoformans 細胞では、約 1.5 ppm という同等のアンモニア測定値が測定されました (図 1c)。 私たちは、針 pH 電極で組織をプローブすることにより、感染した肺の解剖後の pH を測定することで調査を拡張しました。 これらの測定により、ure1Δマウスと比較してWTの肺のpHが有意に高いことが明らかになり（図4d）、これはウレアーゼ陽性動物が感染組織のpHを上昇させるのに十分なアンモニアを生成することを示唆しています。 臓器全体の pH の局所的な変動を制御するために、解剖した肺組織を滅菌食塩水中でホモジナイズし、得られた無細胞上清の pH を標準 pH 電極を使用して測定しました。 in-situ測定と一致して、肺組織ホモジネートのpHは、ure1Δ感染動物と比較してWT由来のものでは有意に高かった(図4d)。 我々の結果は、C.ネオフォルマンス感染のこれまで予期せなかった結果、すなわち、ウレアーゼ活性がガス状アンモニアを放出し、pHの上昇により感染組織の細胞環境を変化させることを明らかにした。

in vitro では pH 値が高くなるとメラニン化が増加するため (図 2)、ウレアーゼに依存した肺 pH の上昇は in vivo でも同様にメラニン化を促進すると仮説を立てました。 残念ながら、銀ベースの染色では細胞壁の多糖類とも反応するため、C. neoformans 細胞のメラ化と非メラ化を確実に区別することはできません 18,19。 この制限にもかかわらず、感染したガレリア メロネラ 20 のヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) 染色切片の周囲組織から、深く色素沈着した C. neoformans 細胞を識別することができました。 同様に、WTまたはure1Δに感染したマウスの肺組織のH&E染色切片において、少数の高度にメラニン化した細胞を検出することができました（図4e、上のパネル）。 メラニンの層は時間の経過とともに細胞壁に徐々に沈着するため 21、検出される色素沈着の多い細胞の数は、メラニン化細胞の総数を過小評価している可能性があります。 WTに感染した肺組織の染色切片では、ure1Δ細胞と比較して、有意に多数のメラニン化細胞が同定された(図4e、左下のパネル)。 WT感染動物とure1Δ感染動物の肺CFUの10倍の差を説明するために、各メラニン化細胞周囲の同等サイズの領域をクリプトコッカス細胞の総数として定量した。 この分析により、ure1Δと比較してWTではメラニン化細胞のパーセンテージが有意に高いことが明らかになりました（図4e、右下のパネル）。 クリプトコッカスメラニンは酸に安定であり22、肺組織サンプルを濃塩酸中で1時間煮沸した後、特徴的な耐酸性メラニン「ゴースト」粒子が検出されました（図4f）。これはure1Δと比較してWTで約3倍豊富でした。 感染肺組織におけるure1Δ細胞と比較してメラニン化WTの数の増加は、メラニン化がウレアーゼ依存性のアンモニア生成によって促進されたという本発明者らのインビトロ観察と一致する。

メラニン化により、マクロファージとの共培養中の C. neoformans の生存率が増加する 4 ため、我々は、非メラニン化またはメラニン化 C. neoformans 細胞を保有するマクロファージをマウスに静脈内感染させることで、この分析を拡張しようとしました。 感染後24時間の動物の肺および脳において、非メラニン化細胞と比較してメラニン化細胞で有意に高い真菌負荷を測定しました（図5a）。 この観察は、メラニン化細胞が非メラニン化細胞よりもファゴリソソーム内で長く存続できるというモデルを裏付けています。 また、非メラニン化尿1∆細胞とメラニン化尿1∆細胞を保有するマクロファージによる感染を比較しました。CFUは肺組織では同等でしたが、脳では非メラニン化細胞と比較して有意に多数のメラ化細胞が存在しました（図5b）。

NM または MEL WT を保有する 2 × 105 個のマクロファージによる静脈内感染の 24 時間後のマウスの肺および脳における真菌負荷の定量化（(a) n = 4、*肺および脳について、それぞれ p = 0.0167 および 0.0300、非対、2-両側パラメトリック t 検定) または ure1Δ ((b) n = 5、NS 有意なし、*p = 0.0414 (脳の場合;対応のない両側パラメトリック t 検定))。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

C. neoformans は、土壌や樹皮などの生息地での生存を促進する、アメーバ状の捕食者から身を守る数多くの保護特性を進化させてきました 23。 この真菌との相互作用におけるアメーバとマクロファージの類似点を考慮すると、これらの多くは病原性因子としても機能します。 たとえば、多糖類のカプセルは環境の乾燥から保護し、クリプトコッカス細胞が宿主免疫系による攻撃を回避できるようにします25。 尿素を加水分解してアンモニアを生成するウレアーゼ 26 や、フェノール前駆体の酸化を触媒してメラニンを生成するラッカーゼ 27 など、他のいくつかの因子が「毒性バッグ」と呼ばれる細胞外小胞 17 で分泌されます。 クリプトコッカス症を治療または予防する取り組みは、これらの要因の 1 つ、たとえばカプセルのグルクロノキシロマンナン (GXM) 糖部分モチーフに基づくワクチン 28 やメラニンに対する抗体 29 などを標的とすることに主に焦点が当てられてきました。 これらの面での協調的な努力にもかかわらず 30、効果的なワクチンはまだ開発されておらず、現在の抗真菌薬レジメンは完全に防御的ではありません 31。 C. neoformans の病原性の多面的な性質を考慮すると、成功する疾患治療または予防戦略の開発には、個々の病原性因子間の相互作用の可能性を考慮した組み合わせアプローチから利益が得られる可能性があります。

ウレアーゼは微生物内で広く発現している酵素であり、尿素から窒素を得る栄養的な役割を果たすと同時に、ヘリコバクター ピロリ、プロテウス ミラビリス、肺炎桿菌などの菌類を含む多くの病原性細菌種に対する毒性因子としても倍増します。 C. neoformans および Coccidioides posadasii として 26,35。 これらの微生物による尿素のアンモニアへの変換は、組織損傷を誘発し、低 pH 環境を緩衝することによって病因に寄与します 36。 ヘリコバクター・ピロリによって十分な量のアンモニアが生成されるため、人間の呼気中のアンモニアの存在が感染症の診断に使用されます37。 肺にウレアーゼ陽性のC.ネオフォルマンス細胞という多量の真菌を担持したマウスの呼気中に、少量ではあるが測定可能な量のアンモニアガスが検出され、クリプトコッカス感染時のウレアーゼ活性が確認された。 アンモニアは、いくつかの真菌種の成長と発生の結果を変化させることができるシグナル伝達分子として機能することがわかっています 38,39,40。 したがって、病原性におけるウレアーゼの作用を考慮する場合、病因形成中に組織を通って拡散して遠隔的に作用する可能性があるその生成物の作用を考慮することも重要です。 私たちは、ウレアーゼの揮発性生成物であるアンモニアが離れた場所で pH を上昇させ、隣接する細胞のメラニン化を促進するため、ファゴリソソーム内の pH を調節するという役割を超えた、ウレアーゼの予期せぬ役割を発見しました 5。 アルカリ性 pH は、メラニン前駆体の重合に必要な化学反応を促進し 10、反応を触媒する酵素であるラッカーゼ 1 の発現と細胞壁局在化も増加させるため、多面的なメカニズムを通じてメラニン生成に影響を与えます。 メラニン化および非メラニン化C.ネオフォルマンス細胞を保有するマクロファージによるマウス感染の結果を比較したところ、おそらくトロイの木馬機構による遊出を促進するためにマクロファージ内のクリプトコッカス細胞の生存を延長することにより、メラニン化が脳浸潤を増加させることが判明した。 私たちの発見は、ある細胞内で作動する病原性機構がどのようにして隣接する細胞の病原性を遠隔調節できるかを明らかにし、感染時の微生物細胞による細胞内コミュニケーションの新たな機構を確立するものである。

ウレアーゼがメラニン化を促進するのに対し、メラニン化細胞はウレアーゼを介したアンモニア放出の減少を示しました。 メラニン前駆体の存在下での C. neoformans の増殖はウレアーゼ発現に影響を与えません 41 が、クリプトコッカスの細胞壁へのメラニンの沈着により細胞壁の多孔性 42 と細胞のリポソームへの透過性 15 が低下します。 我々は、メラニン化が細胞内部からの細胞外小胞の放出も妨げること、そしてウレアーゼは小胞内で輸送される病原性因子の1つであるため、これによってメラニン化細胞のウレアーゼ活性が低下することを発見した。 C. neoformans の増殖は低 pH11 で促進され、アルカリ条件下では阻害されるため（図 2d）、メラニン化によりウレアーゼ含有小胞の放出が減少し、その結果アンモニアの生成が制限され、増殖に最適な pH 範囲内に pH が維持されます。 我々は、ウレアーゼとメラニン化の逆関係が、環境条件の変化に応じてウレアーゼ活性を迅速に微調整する手段を真菌細胞に提供するフィードバック機構を提供するというモデルを提案します（図6）。

C.ネオフォルマンスの複製は低pHで促進されますが、個体数密度が増加すると、ウレアーゼを介したアンモニアガスの放出も増加し、よりアルカリ性の環境が生成されます。 高pHでのメラニン化の促進と複製の遅延の組み合わせにより、ファゴソーム内でのクリプトコッカス細胞の生存期間が延長され、トロイの木馬機構を通じて脳への播種が増加します。 細胞壁へのメラニンの沈着は、ウレアーゼを運ぶ細胞外小胞の放出を妨げることによってフィードバック機構を提供し、アンモニアレベルを低下させ、最適な増殖pHを回復します。 より速い増殖速度は、食細胞からの溶解性放出の発生率を増加させ、血液脳関門を横切る遊離酵母細胞の通過を促進すると予想される。

2 つの病原性因子、ウレアーゼ活性とメラニン化の間の相互依存関係は、C.ネオフォルマンスの病因における新たな特性を構成し、感染の過程で発生する時間的および空間的変動中に真菌の生存を最大化するのに役立ちます。 吸入後、侵入したクリプトコッカス細胞は肺マクロファージに飲み込まれ、この遭遇によりいくつかの結果が生じる可能性があります。 宿主細胞が酵母を殺すこともあれば、真菌細胞が食作用宿主細胞内で生き残って複製することもあり、最終的には溶解性または非溶解性エキソサイトーシスを引き起こします8。 ウレアーゼは、尿素からアンモニアへの変換によりファゴソームの pH が上昇し、細胞内増殖速度が低下して宿主細胞内でのクリプトコッカス細胞の生存を促進するため、この最初の病原体と宿主の相互作用の結果において中心的な役割を果たします 5。 C.ネオフォルマンスは、病原性真菌の中でも顕著な神経向性を示す点で珍しく、クリプトコッカス症のほとんどの症例は髄膜脳炎として現れます。 播種性脳感染症では、クリプトコッカス細胞が遊離酵母細胞として、または「トロイの木馬」機構によってマクロファージ内に運ばれて血液脳関門を通過する必要があります43。 ウレアーゼは前者のルートでは重要な役割を果たします 6,7 が、後者のルートではそれほど重要ではない可能性があります。 我々の結果は、メラニン化がファゴリソソーム内での生存期間を延長することにより、細胞がマクロファージ内で脳内に運ばれ、ウレアーゼの損失を少なくとも部分的に補う頻度を増加させる可能性があることを示唆している。

要約すると、C. neoformans の 2 つの主要な病原性因子が相互に調節し、ウレアーゼが揮発性アンモニアを生成し、遠方での作用により隣接細胞への影響を媒介して pH を上昇させ、それによってメラニン化を促進し、その結果、ウレアーゼ活性が低下することを報告します。酵素を運ぶ小胞の分泌を阻害します。 メラニンとウレアーゼ生成の相互調節により、クリプトコッカス症のさまざまな段階での生存と播種を促進できる、さまざまな特性と回復力を備えた真菌細胞が生成されます。 複数の病原性因子を発現する微生物の場合、それらの複合的な影響が予測できない可能性があるため、これらを相互に関連させて研究することが重要です。 実際、C. neoformans における個々の病原性因子間のさらなる相互作用の興味深い可能性は、今後の研究を正当化するものである。 例えば、pH 544 と比較して pH 7 で増殖させた場合の細胞の莢膜は大きくなるため、ウレアーゼも莢膜の成長に影響を与えると予想されます。ここで説明したクリプトコッカス感染時のウレアーゼとメラニン生成との相互依存関係は、以下のことからも予測できない新たな特性を明らかにします。既知の個々の関数に還元することもできません。 個々の病原性因子間の調整は、宿主と微生物の相互作用のレベルでの病原性の出現に寄与する可能性があり 45、この複雑性の認識は、微生物の病原性を標的とする将来の取り組みの指針となるはずである。

すべての動物手順は、承認されたプロトコル番号 MO21H124 に基づいて、ジョンズ ホプキンス大学の動物管理使用委員会 (IACUC) からの事前承認を得て実行されました。 マウスの取り扱いおよび適切なチャンバー内での CO2 による安楽死は、米国獣医師会の安楽死に関するガイドラインに従って実施されました。 ジョンズ・ホプキンス大学は、動物福祉法の規制および公衆衛生サービス (PHS) の方針に準拠し、AAALAC インターナショナルの認定を受けており、NIH 実験動物福祉局による PHS 承認動物福祉保証を取得しています。

野生型クリプトコッカス ネオフォルマンス血清型 A 株 KN99α およびラッカーゼ 1 欠失変異体 lac1Δ は、Fungal Genetics Stock Center 遺伝子欠失ライブラリーから入手しました 46。 ラッカーゼ 2 欠失変異体、lac2Δ (RPC 26)13 は、Joseph Heitman および J. Andrew Alspaugh (デューク大学、ノースカロライナ州) から入手しました。 ウレアーゼ欠損変異体 ure1Δ26 と GFP ラッカーゼ 1 株 14 は、それぞれ John Perfect (デューク大学、ノースカロライナ州) と Peter Williamson (NIH、メリーランド州) のご厚意により提供していただきました。

WT または ure1Δ 凍結 50% グリセロール ストックから酵母エキス - ペプトン - デキストロース (YPD) 培地中で 30 ℃ で増殖させて回収したクリプトコッカス ネオフォルマンス細胞を、各図の凡例に指定された細胞密度で尿素ブロス 9 に継代培養し、 24 ウェル プレートの指定されたウェル。 残りのウェルに無細胞尿素ブロスをロードした後、プレートをパラフィルムで密封し、30 °C で指定の時間インキュベートしました。 無細胞培地の色の黄色からピンクへの変化は、尿素ブロスで増殖する細胞から拡散したアンモニアの結果として pH が上昇したことを示しています。 12メガピクセルのカメラを使用してプレートの写真を撮影し、SpectraMax iD5マルチモードマイクロプレートリーダー（Molecular Dynamics）を備えたSoftmax Pro 7.1ソフトウェアを使用して、各無細胞ウェルの560 nm（A560）の吸光度を測定しました。 尿素ブロス対照のA560を各測定値から差し引いた。 WT 細胞を 29.4 mM K2HPO4、10 mM MgSO4、13 mM グリシン、15 mM からなる最少培地 (MM) で 6 日間予備増殖させた点を除いて、非メラニン化細胞とメラニン化細胞からのアンモニア拡散を比較するために同様の方法を使用しました。 D-グルコース、pH 5.5 の 3 μM チアミン、または尿素ブロス中で 5 × 107 細胞/mL の密度で継代培養する前に、1 mM ドーパミン塩酸塩 (DA、MilliporeSigma H8502) を添加した MM。

WT 細胞を、同じ開始細胞密度 1 × 108 細胞/mL および一定範囲の尿素濃度、または一定の尿素濃度 2% および一定範囲の開始細胞密度で、尿素ブロス中で 30 °C で 24 時間増殖させました。 。 ure1Δ 対照培養物を、2% 尿素を含む尿素ブロスに 1 × 108 細胞/mL の細胞密度で接種しました。 0 ～ 200 ppm の範囲の BT-5800G アンモニア ガス検出器のセンサーを、各培養液 1 mL が入った 1.5 mL コニカル チューブの真上に 30 秒間保持し、測定値を記録しました。 各 WT 培養の測定値は、ure1Δ コントロールの低バックグラウンド測定値を差し引くことで補正され、最大値 200 ppm のパーセンテージとして表されました。 2500 g で 5 分間遠心分離して収集した無細胞上清の A560 を測定し、無細胞尿素ブロスのバックグラウンド吸光度を差し引き、最大読み取り値のパーセンテージとして表しました。

0.1 または 1 mM DA および 1.5% 寒天を補充した MM を 48 ウェル プレートの指定されたウェルに分注し、固化させました。 DA を添加した寒天の各ウェルにリン酸緩衝食塩水 (PBS) で洗浄した WT 細胞 5 × 105 個をスポットし、WT または ure1Δ をウェル A1 で 5 × 107 細胞/mL の細胞密度で尿素ブロス中で培養しました。同じプレートのＡ６を、１３、２６、３９、５２、６５、７８、または９１ｍｍの距離でメラニン化をアッセイした。 パラフィルムで包まれたプレートを 30 °C で 24 時間インキュベートし、12 メガピクセルのカメラを使用して写真を撮影しました。 Adobe Photoshopを使用して画像をグレースケール画像に変換し、Image Studio Lite 5.2ソフトウェア(Li-Cor Biosciences)を使用して各スポットの色素沈着の強度を定量化した。 アンモニアの拡散によってもたらされるメラニン化の正味の増加を導き出すために、ure1Δ プレートの各ウェルの色素沈着測定値を、WT プレートの対応するウェルの色素沈着測定値から差し引いた。 このアッセイのバリエーションを使用して、上記のように WT または尿素ブロス中の ure1Δ を含むウェルに隣接する 1 mM DA 添加寒天上で WT、lac1Δ、および lac2Δ によるメラニン化を比較しました。

1 mM DA、5 mM アスコルビン酸 (高 pH で発生する DA の自己重合を最小限に抑えるため)、および 20 mM Tris-HCl、20 mM Bis-Tris、および 20 mM 酢酸ナトリウムからなるユニバーサル緩衝液システムを添加した MM、を所望のｐＨに調整し、次いで１．５％寒天と混合し、４ウェルプレートのウェルに分注した。 固化した寒天に 5 × 105 個の PBS 洗浄 WT 細胞をスポットし、30 °C で 48 時間インキュベートした後、プレートの写真を撮影し、前述のように色素沈着を定量しました。 このアッセイのバリエーションを使用して、1 つのウェルに WT または ure1Δ 細胞または無細胞培地を補充した尿素ブロスを含む場合、pH 5.5 および 7.0 の DA 寒天上でのメラニン化を比較しました。 実験終了時の各ウェルの寒天の pH は、ColorpHast pH インジケーター ストリップを使用して測定されました。

野生型 C. ネオフォルマンス細胞を、5 × 細胞を含むウェルから 13、26、39、または 52 mm 離れた 48 ウェル プレートのウェルで、0.25 × YPD ブロス中で 1 × 105 細胞/mL の密度で 3 回継代培養しました。尿素ブロスに 107 個の細胞。 パラフィルムで密封したプレートを、Spectromax iD5 プレートリーダーで連続的に軌道振盪しながら 30 °C でインキュベートし、600 nm での吸光度を 36 時間にわたって 15 分間隔で読み取りました。

GFP タグ付きラッカーゼ 114 を発現する C. neoformans 株を、酵母エキス-ペプトン-デキストロース (YPD) 培地中で 30 °C で増殖させることにより、凍結 50% グリセロールストックから回収し、その後 10 μM C​​uSO4 を添加した MM に 1 分間継代培養しました。 30℃で3日間。 細胞を新しい培地に洗浄し、3 枚の 24 ウェル プレートの列 2 ～ 6 のウェルに分注し、尿素ブロス中の 8 × 107 WT 細胞を列 1 の各ウェルに配置し、プレートをパラフィルムで密封しました。 30 °C で 24 時間インキュベートした後、カラム 2 ～ 6 (距離 19.3、38.6、57.9、77.2、または 96.5 mm) の生細胞の明視野および GFP 蛍光 (それぞれ励起波長と発光波長 488 nm および 520 nm) 画像アンモニアを生成する細胞から）は、油浸100倍対物顕微鏡を使用したOlympus AX70顕微鏡（ペンシルベニア州センターバレーのオリンパス）上のRetiga 1300デジタルCCDカメラ（Teledyne Photometrics、アリゾナ州ツーソン）を備えたQCapture-Pro 6.0ソフトウェアを使用してキャプチャされました。 各カラムの 4 つのウェルからの細胞をプールし、2500 g で 5 分間遠心分離し、その後、accumet AB150 pH メーター (Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA) を使用して培養上清の pH を測定しました。 細胞ペレットを500 μLの培地に再懸濁し、それぞれ485 nmと535 nmの励起波長と発光波長を使用して蛍光を定量しました。

MM または 1 mM DA を添加した MM のいずれかで 30 °C で 4 日間増殖させた WTC. neoformans 細胞を PBS で洗浄し、しっかりと蓋をした中で 1 × 108 細胞/mL の密度で尿素ブロスに 3 回継代培養しました。 14 mL チューブ。 30℃で指定の時間インキュベートした後、培養サンプルをCostar Spin-X 0.45 µmスピンフィルターで10,000 gで2分間遠心分離して濾過し、無細胞濾液のA560を測定しました。 各培養物の開始細胞密度は、それぞれの10-6希釈物をサブローブドウ糖（SAB）寒天上にプレーティングし、30℃で2日間インキュベートした後コロニー形成単位（CFU）を計数することによって決定しました。

非メラニン化およびメラニン化 C. neoformans 培養物の上清中の細胞外小胞は、以前に記載されているように、蛍光親油性プローブ、1, 6-ジフェニル-1, 3, 5-ヘキサトリエン (DPH) を使用して定量されました 47。 5 つの生物学的複製培養物を MM または 1 mM DA を添加した MM に 1 × 108 細胞/mL の細胞密度で接種し、30 °C で 24 時間インキュベートした後、10 μg/mL DPH を含む新鮮な培地に継代培養しました。 。 30℃でさらに24時間インキュベートした後、2500gで5分間の2回の連続遠心分離により無細胞上清を得た。 蛍光は、それぞれ360 nmと430 nmの励起波長と発光波長で定量化され、生の測定値は、無細胞対照培地で測定されたバックグラウンド蛍光を差し引くことによって補正されました。

細胞外小胞 (EV) は、以下の修正を加えた前述のプロトコール 16 を使用して、固体培地で増殖させた C. neoformans 細胞から単離されました。 YPD培地中で30℃で24時間増殖させて凍結50%グリセロールストックから回収したWT細胞またはΔlac1細胞をPBSで洗浄し、その後1×107個の細胞を1:1培地20mLを分注して調製した固体培地プレート上に広げた。 3% 寒天と、10 μM 尿素を添加した MM、または 10 μM 尿素と 1 mM DA を添加した MM のいずれかの混合物。 30℃で48時間インキュベートした後、滅菌接種ループを使用して細胞を寒天表面から注意深く回収しました。 2 枚のプレートからの細胞を、各変数について 3 回反復して総量 3 mL の滅菌 PBS に懸濁しました。 細胞数は、血球計を使用して各サンプルの希釈を計数することによって定量化された。 室温で4000gで15分間遠心分離した後、上清を新しいチューブに移し、室温で14,000gで15分間遠心分離した。 0.8 µm フィルターを通過させた後、細胞を含まない上清を 270,000 g、10 °C で 1 時間遠心分離しました。 EV ペレットを 100 μL 10 mM リン酸ナトリウム、pH 7.0 に再懸濁しました。

相対的な EV 収量は、提供されたプロトコールに従って Amplex RED コレステロール アッセイ キット (Invitrogen、A12216) を使用してエルゴステロール含有量を定量することによって比較されました。 簡単に説明すると、25 μL の各 EV 調製物を 37 °C で 30 分間反応させた後、それぞれ 550 nm と 590 nm の励起波長と発光波長で蛍光を定量しました。 コレステロールを含まない対照反応について測定されたバックグラウンド蛍光を差し引くことによって生の測定値を補正した後、エルゴステロール濃度 (μg/mL) をコレステロール標準曲線から外挿しました。

ウレアーゼ活性は、製造業者の指示に従ってウレアーゼ活性アッセイキット（Sigma、MAK120）を使用し、Berthelot 法により各 EV 調製物 25 μL について定量しました。 吸光度を 670 nm で読み取り、式 (A670 サンプル – A670 ブランク) × n / (傾き × t) を使用してアンモニア標準曲線から外挿してウレアーゼ活性 (単位/L) を計算しました。ここで、n は希釈係数であり、 t は時間、ブランクはバッファーのみのアッセイ コントロールです。

動物実験は、目標室温22℃、許容範囲19～25℃の施設で飼育された5～7週齢のメスのC57BL/6 Jマウス（ハツカネズミ）（Jackson Laboratories）を使用して実施されました。 、目標室内湿度は 42%、許容範囲は 30 ～ 70%、明サイクルは 14.5 時間、暗サイクルは 9.5 時間です。 50 mg/kg ケタミンと 5 mg/kg キシラジンの混合物を腹腔内注射してマウスを麻酔し、滅菌 0.9% 生理食塩水中の約 5 × 105 個の WT または ure1Δ 細胞を鼻腔内に感染させました。 1% ペニシリン-ストレプトマイシン (P/S) を添加した SAB 寒天培地上に段階希釈液をプレーティングすることによって定量化された各接種材料の CFU は、WT および ure1Δ についてそれぞれ 5.8 × 105 および 6.3 × 105 でした。 モデル動物の性別は、C. neoformans 感染症の確立されたプロトコールに準拠するために選択されており 5,26 、実験の結果に影響を与えるとは考えられていません。

50 mL 遠心分離管 (Fisher Scientific、06-443-19) の円錐形の先端を取り外し、BT-5800G アンモニア ガス検出器のセンサーを遠心分離管にしっかりと取り付けました。 ケタミン/キシラジン麻酔下（上記のとおり）、WTまたはure1Δに20〜22日間感染させた動物を、キャップをしっかりと閉めた状態でチューブ内に置き、2分後にガスメーターの測定値を記録しました。

WTまたはure1Δに20～22日間感染したマウスは、致死量のケタミン/キシラジンを腹腔内注射することによって安楽死させた（肺に多量の真菌負荷によりすでに重篤な状態にあったWT感染動物の場合は50 mg/kg、または150 mg/kg）。 ure1Δ感染動物の場合はmg/kg）。 感染した肺組織を解剖によって露出し、アキュメット AB150 pH メーターおよび Ag/AgCl 参照電極と組み合わせた MI-407 針 pH 電極 (Microelectrodes Inc.、ニューハンプシャー州) でプローブしました。 DeltaRange分析天秤(Mettler Toledo AT261)を使用して肺の重量を測定した。 100 μm セルストレーナーを通過させることにより滅菌 0.9% 生理食塩水中でホモジナイズした肺および脳組織を段階希釈し、SAB + P/S 寒天上にプレーティングして各臓器の CFU を定量しました。 均質化された肺組織のサンプルも 10,000 g で 5 分間遠心分離し、得られた上清の pH をアキュメット AB150 pH メーターを使用して測定しました。

WT または ure1Δ に感染した 3 匹のマウスから切除した肺組織サンプルを、中性緩衝 10% ホルマリン中で 4 °C で固定し、ジョンズ・ホプキンス大学腫瘍組織サービスによる組織学的分析に提出しました。 パラフィン包埋サンプルから切り取った薄切片 (4 μm) を Superfrost Plus スライドにマウントしました。 脱蝋および PBS ですすいだ後、切片をヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) で染色し、スキャンしました。

マウス肺組織を 3 mL の 0.9% 生理食塩水中でホモジナイズし、等量の濃塩酸 (12 N) と混合し、水浴中で 95 °C で 1 時間加熱しました。 冷却したサンプルを 10,000 g で 30 分間遠心分離し、耐酸性物質を 200 μL PBS に再懸濁しました。 ウェットマウントは、スライド上に 8 µL のサンプルを塗布することによって準備され、100 倍の油浸対物レンズを備えたオリンパス AX70 顕微鏡を使用して明視野照明下で検査され、Retiga 1300 デジタル CCD カメラを備えた QCapture-Pro 6.0 ソフトウェアを使用して画像がキャプチャされました。 それぞれ 3 枚のスライドから特定されたメラニン ゴースト粒子の総数は、WT 感染マウスおよび ure1Δ 感染マウス由来の肺組織ではそれぞれ 29 個と 8 個でした。

骨髄由来マクロファージ (BMDM) を C57BL/6 J マウスから抽出し、以前に記載されているように分化させました 5。 ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、10％ウシ胎児血清（FBS）、1％非必須アミノ酸、1％ペニシリン-ストレプトマイシン、2mM GlutaMAX、1％HEPES緩衝液、0.1％からなるBMDM培地中で細胞を分化させました。 2-メルカプトエタノール、および 20% L-929 細胞で調整した上清を 100 mm の未処理培養ディッシュ (Corning、430591) に入れ、37 °C、9.5% CO2 で 6 ～ 7 日間培養しました。 分化した細胞をハンクス平衡塩類溶液 (HBSS) で洗浄し、Cellstripper で 37 °C で 10 分間処理することにより培養皿から剥がしました。 細胞をBMDM培地に洗浄し、6ウェルプレートにウェルあたり5×105細胞の密度で播種し、37℃、9.5%CO2で24時間インキュベートしました。 MM (非メラニン化) または 1 mM DA を添加した MM (メラニン化) で 30 °C で 3 日間増殖させた WT または ure1ΔC. ネオフォルマンス細胞を、5 × 105 細胞/mL の細胞密度で BMDM 培地に洗浄しました。 2 μg/mL 18B7 mAb48 と室温で 30 分間インキュベートすることによりオプソニン化しました。 BMDM の各ウェルの培地を 1 × 106 C. neoformans 細胞を含む培地に交換し、感染を 37 °C で 1 時間進行させました。 感染したBMDMをHBSSで3回洗浄して遊離酵母細胞を除去し、その後滅菌0.9% USP生理食塩水で洗浄した。 5〜7週齢の雌C57BL/6 Jマウス（Jackson Laboratories）を、50 mg/kgのケタミンと5 mg/kgのキシラジンの混合物の腹腔内注射によって麻酔し、眼窩後注射によってC.ネオフォルマンスを含むBMDMに感染させた。約 2 × 105 セル。 各接種材料のCFUは、滅菌H2O中でBMDMを溶解し、段階希釈物をSAB + P/S寒天上にプレーティングすることによって定量した。 24 時間後、感染した動物を CO2 吸入によって安楽死させ、解剖した肺と脳を 100 μm のセルストレーナーに通すことによって滅菌 PBS 中でホモジナイズしました。 各組織ホモジネートの段階希釈物をSAB + P/S 寒天上にプレーティングし、接種材料のCFUのわずかな差についてCFUカウントを補正しました。

データはグラフ化され、GraphPad Prism 9 ソフトウェアを使用して統計的有意性について分析されました。 散布図の各データ ポイントは独立した生物学的複製を示し、水平線は中央値を示します。 統計分析は、2 つのデータセットの比較には対応のない両側パラメトリック t 検定を使用するか、3 つ以上のデータセットの分析には Tukey の多重比較検定を使用した通常の一元配置分散分析 (ANOVA) を使用して実行されました (ns = 有意ではありません) 、*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001)。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

著者らは、この研究の結果を裏付けるデータが論文内で入手可能であることを宣言します。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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専門的な組織学的画像処理を提供してくださったジョンズ・ホプキンス大学腫瘍学組織サービスに感謝いたします。 この研究は、国立衛生研究所の助成金番号 R01-HL059842 (AC) によって支援されました。

分子微生物学および免疫学部門、ジョンズ・ホプキンス大学ブルームバーグ公衆衛生大学院、ボルチモア、メリーランド州、21205、米国

ロザンナ・P・ベイカー & アルトゥーロ・カサデヴァル

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RPB と AC がこのプロジェクトを発案しました。 RPB は方法論を開発し、データを取得して分析し、原稿を執筆しました。 ACは原稿を編集し、資金を獲得した。

アルトゥーロ・カサデヴァルへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Agostinho Carvalho と他の匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Baker, RP、Casadevall, A. アンモニアとメラニン生成の相互調節は、クリプトコッカスの毒性に影響を及ぼします。 Nat Commun 14、849 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-36552-7

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受信日: 2022 年 8 月 18 日

受理日: 2023 年 2 月 7 日

公開日: 2023 年 2 月 15 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36552-7

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