共生細菌綱内の系統によるプロパンの嫌気性酸化と硝酸塩還元の結合

Nature Communications volume 13、記事番号: 6115 (2022) この記事を引用

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嫌気性微生物は、陸上および水生生態系から大気への短鎖ガス状アルカン (SCGA; エタン、プロパン、ブタンを含む) のフラックスを制御する上で重要な役割を果たしていると考えられています。 硫酸塩は、SCGA の微生物による嫌気性酸化をサポートする電子受容体として機能することが確認されていますが、他のいくつかのエネルギー的により好ましい受容体が嫌気性環境においてこれらのガスと共存します。 今回我々は、廃水処理施設からのバイオマスを播種したバイオリアクターが、硝酸塩の二窒素ガスとアンモニウムへの還元と組み合わせた嫌気性プロパン酸化を実行できることを示す。 バイオリアクターは 1000 日以上稼働し、13C および 15N 標識実験、メタゲノム分析、メタトランスクリプトーム分析、メタプロテオーム分析および代謝産物分析を使用して、微生物群集と代謝プロセスを特徴付けました。 これらのデータは、観察された硝酸塩依存性プロパン酸化の原因は、細菌綱シンバイオバクテリア内で新しい順序を表す種であることを総合的に示唆しています。 我々が「Candidatus Alkanivorans nitratireducens」と名付けたこの生物の閉鎖ゲノムは、フマル酸塩の添加によるプロパンのCO2への酸化と硝酸塩の還元の経路をコードしており、重要な遺伝子はすべて硝酸塩依存性のプロパン酸化中に発現する。 我々の結果は、硝酸塩が嫌気性環境におけるSCGA酸化に関連する電子シンクであり、炭素と窒素の循環の間に微生物を介した新たなリンクを構成していることを示唆している。

かなりの量の天然ガスが、深海の堆積物や大陸縁辺および陸上生態系の炭化水素の浸出から生成されます1、2。 放出された天然ガスのほとんどは、ガスが酸素環境や大気中に拡散する前に、無酸素地帯の微生物によって消費されます3、4、5。 天然ガスの嫌気性酸化の研究は、最も豊富な成分（約 60 ～ 90%）として強力な温室効果ガスであるメタンに焦点を当ててきました6,7。 しかし、エタン、プロパン、n-ブタン、イソブタンなどの短鎖ガス状アルカン (SCGA) も天然ガスの実質的な構成成分 (最大約 20%) であり 8、オゾンや有機エアロゾルの重要な前駆体です 9。 SCGA の大気排出量は、エタンで 9.2 ～ 9.6 Tg / 年、プロパンで 9.6 ～ 10.5 Tg / 年、ブタンで 10 Tg / 年、イソブタンで 4.2 Tg / 年と推定されています10。

メタンの嫌気性酸化 (AOM) は広く研究されており、比較的よく理解されています 7、11、12、13、14、15、16、17。 嫌気性メタン栄養古細菌 (ANME) は、重要なメチル-CoM レダクターゼ (MCR) 複合体を含む逆メタン生成経路を介してメタンを酸化します。 ANME はメタンから共栄養性硫酸塩還元細菌 (SRB) 11,12 に電子を往復させたり、硝酸塩や金属酸化物の還元に直接電子を伝えたりします 13,14,15,16。 細菌「カンジダトゥス メチロミラビリス オキシフェラ」は、亜硝酸塩を唯一の電子受容体として使用する「好気性内」メタン酸化経路を介して AOM を実行します17。 微生物はまた、無酸素条件下での SCGA の酸化とこれらの電子受容体の還元を結びつける可能性があります 18。 「Ca. M. oxyfera は、メタンモノオキシゲナーゼを介してエタンとプロパンを酸化できることが示されていますが、これらの炭素源が増殖をサポートするかどうかはまだ示されていません 19。 現在まで、硫酸塩は、SCGA の嫌気性酸化をサポートすることが確認されている唯一の電子シンクです 20、21、22、23、24、25。 デルタプロテオバクテリア分離株 Desulfosarcina aeriophaga BuS5 は、アルキル置換コハク酸塩を生成するフマル酸付加経路（アルキルコハク酸シンターゼ (ASS) 20,21 を介するプロセス）を介してプロパンとブタンを酸化し、硫酸塩を硫化物に直接還元します。 古細菌「カンジダトゥス・シントロフォアーキウム」の濃縮により、分岐型MCRによって触媒されるプロセスであるブチル補酵素M形成を介してブタンが活性化され、還元等価物が共栄養性SRB​​パートナーに送られることが判明した23。 同様に、嫌気性エタン酸化は、同様に MCR 様複合体をコードする関連する「Candidatus Argoarchaeum ethanivorans」と関連しており、SRB22 と共栄養関係を形成することが示唆されました。 しかし、硫酸塩の還元と直接結合する嫌気性プロパン酸化を媒介できる古細菌はまだ特定されていない。

硫酸塩と同様に、硝酸塩は自然生態系における一般的な電子受容体であり 26、ANME 古細菌「Ca」によって使用されます。 AOM13のMethanoperedens nitroreducens'。 SCGA の酸化と組み合わせた硝酸塩の還元 (式 (1)、例としてプロパンを使用) も、硫酸塩の還元と組み合わせた SCGA の酸化の反応 (△Go'= −102 kJ/mol プロパン) と比較して、熱力学的に実行可能です。 、しかし、まだどの微生物系統とも関連付けられていません。

今回我々は、質量および電子平衡試験、13Cおよび15N標識実験、16S rRNA遺伝子アンプリコン配列決定、代謝産物分析およびマルチオミクスアプローチを組み合わせて、共生細菌綱内の新種の細菌種が硝酸塩と結合したプロパンの嫌気性酸化を行うという証拠を提供した。削減。

この研究では、廃水処理施設からのバイオマスを播種した嫌気性バイオリアクターにプロパンと硝酸塩を 1000 日以上パルス供給しました。 長期的なパフォーマンスデータは、プロパンと硝酸塩の同時消費と、アンモニウム、窒素ガスの蓄積、および亜硝酸塩の一時的な蓄積を示しました（補足図1）。 対照インキュベーションでは硝酸塩の消費は観察されず（濃縮培養バイオマスまたはプロパンの添加なし、補足図2）、バイオリアクター内のプロパン消費と連動した硝酸塩の減少（亜硝酸塩、アンモニウム、およびN2へ）が微生物によって媒介されたことを示唆しています。 硝酸塩依存性の嫌気性プロパン酸化反応を確認し、その最終生成物を検証するために、親リアクターからのバイオマスをバッチ実験で 13C 標識プロパン (13CH313CH213CH3) および 15N 標識硝酸塩 (15NO3-) を約 8% 添加してインキュベートしました。それぞれ、総プロパンおよび総硝酸塩の約 1%。 総 CO2 と 13C 標識 CO2 の量は増加し、それに伴って C3H8 と 13C3H8 の減少が見られました (図 1a、b)。 生成された合計 13CO2 (46 μmol) と消費された合計 13C3H8 (19 μmol) の比 (2.42) は、理論上の化学量論比 3:1 に近かった。 炭素バランスは、プロパンが最終生成物として CO2 で酸化されたことを示唆しています。 総 NO3- 消費量 (0.73 mmol) は、N2 と NH4+ の合計生成量 (0.8 mmol) と一致していました (図 1c)。 同様に、15N​​O3- の消費量 (9.38 μmol) は、29N2 (総 N2 の 1.1 ～ 1.5%)、30N2 (総 N2 の 0.03%)、および生成された 15NH4+ 中の 15N に近く、合計で 9.71 μmol に達しました (図1d）。 これらの結果により、硝酸塩が窒素ガスとアンモニアに還元されることが確認されました。 プロパンの嫌気性酸化で生成された電子 (AOP、5.03 mmol) は、NO3- を N2 および NH4+ に還元するための電子要求量 (5.15 mmol) に近かったため、AOP によって生成された電子が脱窒およびアンモニアへの硝酸異化還元に使用されたことが示唆されます (DNRA) ）、以下の反応と一致しています27：

a C3H8 から CO2 への変換、b 13C3H8 から 13CO2、c NO3- から NH4+ および NO2- の一時的な形成を伴う N2、d 15NO3- から 15NH4+ および 15NO2- の一時的な形成を伴う 29N2 への変換。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

化学量論的実験は、窒素と電子のバランスをより正確に確立するために、親反応器と、親システムからのバイオマスを播種したバッチインキュベーションの両方で実施さ​​れました。 硝酸塩/亜硝酸塩の還元は 2 つの異なる段階で起こるようです (図 2a)。 ステージ 1 (硝酸塩が枯渇する前) では、硝酸塩は亜硝酸塩と二窒素ガスに変換され、アンモニウムの生成はごくわずかでした。 ステージ 2 (硝酸塩枯渇後) では、ステージ 1 で蓄積した亜硝酸塩から二窒素ガスとアンモニウムの両方が生成されました。硝酸塩が限界になったときに DNRA が主に発生するという観察は、以前の研究 28、29、30 と一致しています。 三重のバッチテストにおける窒素ガスに対する硝酸塩の消費量とアンモニウム生成量の比（図2a、補足図3）は1.03±0.05（図2b、補足表1）であり、硝酸塩が最終的に完全に窒素ガスに変換されたことを示唆しています（ 57.3 ± 5.5%) およびアンモニウム (42.7 ± 5.5%)。 電子生成（プロパンのCO2への酸化から計算）と電子消費（硝酸塩の還元）の比は1.10±0.01であり（図2b、補足表1）、硝酸塩の還元がプロパン酸化の主な電子シンクであることを示唆しています。

a システムの典型的な生化学プロファイル (1050 日目に開始) は、硝酸塩とプロパンの同時消費と、亜硝酸塩の一時的な形成、および窒素ガスとアンモニウムの生成を示しています。 硝酸塩の還元は 2 つの異なる段階で起こるようです。 ステージ 1 では、硝酸塩は亜硝酸塩と二窒素ガスに変換され、アンモニウムの生成はごくわずかでした。 一方、ステージ 2 では、蓄積した亜硝酸塩から窒素ガスとアンモニウムの両方が生成されました。 b 平均窒素バランスと電子バランスは 3 つのバッチテストから計算されました (完全なデータと計算については補足表 1 を参照)。 エラーバーは標準誤差を表します。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

16S rRNA遺伝子アンプリコン配列決定によるコミュニティプロファイリングにより、接種材料では検出できないにもかかわらず、ファーミクテス門内の未分類の系統に属する細菌の系統型がバイオリアクター内で最も豊富な集団であることが明らかになりました（985日目で20.1％、補足図4）。 優勢な集団の代表的なゲノムを取得するために、1040 日目にサンプリングされたバイオリアクターからのバイオマスに対してロングリード (ナノポア) およびショートリード (イルミナ) のメタゲノム シーケンシング (補足データ 1) が実行されました。メタゲノム データのアセンブリとビニングにより、回収が行われました。 11の完全な環状化ゲノム（補足データ1）を含む、59のほぼ完全なゲノム（CheckM、補足データ1、補足図5に基づく完全性70％以上、汚染度10％以下）のうち。 最も豊富な集団は、ファーミクテス門の共生細菌綱内の新しい順序を表すためにゲノム分類データベース (GTDB) で分類されました (相対存在量の 22.8%、補足表 2)。 我々は、硝酸塩に依存したプロパン分解におけるその能力に基づいて、この細菌に「Candidatus Alkanivorans nitratireducens」という名前を提案します（以下を参照）。 16S rRNA 遺伝子 (1536 bp) は、'Ca. から回収されました。 A. nitratireducens の MAG は、Firmicutes に属する豊富な 16S rRNA 遺伝子アンプリコン配列と同一でした。 'Ca. A. nitratireducens の MAG は完全で、サイズ 2.43 Mbp で環状化していました (補足図 6)。 ゲノムに基づいた系統樹は、「Ca. A. nitratireducens' は、公的に入手可能な Symbiobacteria とは系統発生的に異なりました (図 3a)。 'Ｃａ．の平均ヌクレオチド同一性（ＡＮＩ）およびアミノ酸同一性（ＡＡＩ）。 A. nitratireducens のゲノムは、GTDB の近縁種、つまり Symbiobacteriia ZC4RG38、Symbiobacterium sp003242675、Symbiobacterium Thermophilum のゲノム (ANI と AAI でそれぞれ <75.0% と 53.8 ～ 55.2%) と比較して、「Ca. nitratireducens」の分類を裏付けています。 A. nitratireducens は、Symbiobacteria 綱内の新しい目として分類されます 31。 16S rRNA 遺伝子ツリー (補足図 7) も、「Ca」が 16S rRNA 遺伝子ツリーであることを明らかにしています。 A. nitratireducens は、他の分類された共生細菌とは系統発生的に離れており (16S rRNA 遺伝子同一性が 84.1% 未満) 31、Silva データベースには近縁種がありません。 3 つの FISH プローブ (SYMB-1018、SYMB-624、および SYMB-186) が設計され、バイオリアクター バイオマスに個別に適用されて、Ca の形態と空間配置が視覚化されました。 A. nitratireducens の細胞。 バイオマスの顕微鏡検査により、細胞が細胞外ポリマー物質様マトリックスに埋め込まれているように見える拡散したフロックが明らかになった。 「Ca. A. nitratireducens は、埋め込まれた棒状細胞（〜0.5μm×1.5μm）として現れ、時には凝集体（最大〜50μm）を形成し、フロック全体に豊富で比較的均一に分散していました（図3bおよび補足図8）。 細胞の形態と空間配置は 3 つのプローブすべてで一貫しており、その特異性に信頼性が得られました (補足図 8)。

ゲノムベースの系統樹。 'Ca. この研究からの A. nitratireducens のゲノムは赤い文字で強調表示されています。 黒と白の点は、それぞれ >90% と >70% のブートストラップ値を表します。 スケールバーは部位ごとのアミノ酸置換を示します。 b SYMB-1018 FISH プローブ (Cy3、赤色、「Ca.A. nitratireducens」をターゲットとする) とハイブリダイズし、DAPI (青色、すべての微生物細胞) で染色した濃縮培養物の複合蛍光顕微鏡写真。 「Ca. A. nitratireducens の細胞はマゼンタ色 (青 + 赤) で表示されます。 スケールバーは20μmを示します。 代表的な画像は、6 回の別々のハイブリダイゼーション実験の視覚的評価に基づいて選択されました。 'Ca' を標的とする 2 つの追加プローブを使用しても、一貫した結果が独立して得られました。 A. nitratireducens の集団 (補足図 8)。 c、d 各ゲノムとビン化されていないコンティグの相対的な発現、およびバイオリアクター内のゲノムの対象となる微生物の代謝。 各遺伝子について、100 万あたりの総転写産物 (TPM) を計算しました。 総TPMの全体的な発現が1%を超えるゲノムセットを示します(c)。 KEGG アノテーションを使用して、脱窒 (M00529) および硝酸塩のアンモニウムへの異化的還元 (M00530) 経路をコードする ORF を特定しました (d)。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

「Ca」の注釈。 A. nitratireducens の MAG は、2 つの AssD（同一のアミノ酸配列）と 3 つの AssA サブユニット（アミノ酸配列の 89.3 ～ 90.7% の類似性、補足図 9）を含む ASS 複合体の遺伝子を同定しました。フマル酸塩添加による SCGA20、32。 'Ca.の位置合わせ。 NCBI データベースに相同配列を持つ A. ニトラティレデューセンスの AssA アミノ酸配列は、重要なアミノ酸残基 (AssA1 の Gly828 と Cys489、AssA2 の Gly501 と Cys169、AssA3 の Gly828 と Cys489、補足図 10) の保存を確認しました。フマル酸付加酵素の機能にとって重要33。 系統解析により、「Ca」の AssA と AssD が異なることが明らかになりました。 A. nitratireducens は、NCBI および UniRef データベースのフマル酸付加酵素 (AssAD および BssAD) から系統発生的に離れています (図 4c; 補足図 11)。 さらに、「Ca. A. nitratireducens の MAG には、炭素骨格再構成のためのメチルマロニル CoA ムターゼ遺伝子 (mcmA)、脱炭酸のためのプロピオニル CoA カルボキシラーゼ遺伝子 (pccB)、およびベータ酸化 34,35 (図 5; 補足データ 2)。 ベータ酸化により生成されたアセチルCoAは、CO2への完全な酸化のため、またはその後のプロパン活性化ラウンドのためのフマル酸塩の再生のため、酸化的トリカルボン酸（TCA）サイクルに入る可能性があります（図5）。 イソブチリル-CoAは、メチルマロン酸セミアルデヒドを介してプロピオニル-CoA36に酸化され、これを利用してメチルマロニル-CoA経路を介してフマル酸塩を再生することができる（図5）。 CO デヒドロゲナーゼ:アセチル CoA シンターゼ (CODH/ACS) および逆ウッド-ユングダール (WL) 経路の遺伝子は、'Ca. A. nitratireducens」は、アセチルCoAのCO2への末端酸化がCODH / ACSと、誘導されたC1ユニットの段階的脱水素によって媒介される可能性があることを示唆しています37、38（図5、補足データ2、補足表3）。 CO2 生成のためのこの WL 経路は、硫酸塩依存性プロパン分解 Desulfosarcina aeriophaga BuS521 について提案されている経路と一致しています。 現在、共生細菌類には GTDB データベースに 3 つのゲノムしか含まれておらず、嫌気性プロパン代謝に使用できる代謝モデルはありません。 したがって、「Ca」の代謝モデルを構築するにはさらなる研究が必要です。 TCA および WL 経路の炭素流を計算し、細胞がこれら 2 つの経路をどのように調節するかを理解するために、A. nitratireducens を使用しました。

a 濃縮培養抽出物 (n = 3、さまざまな時点で取得) の部分イオンクロマトグラム (イオン遷移、m/z: 289 > 147.2) により、保持時間 10.832 分のピークが明らかになり、コハク酸イソプロピル標準のピークと一致しました。 。 b 濃縮培養物からの細胞抽出物では、コハク酸プロピル標準のピークに対応する保持時間 11.078 分のピーク (イオン遷移、m/z: 289 > 147.1) が観察されました (異なるサンプリングポイントで n = 3)。 c 'Caの系統関係。 A. nitratireducens の AssA (赤) から NCBI データベース内の他の AssA および BssA へ。 3 つの AssA サブユニット (AssA123) が Ca に見つかりました。 A. nitratireducens の MAG は別のクラスターを形成しました。 ブートストラップ値 >90% は、ブランチ ノード上の黒い点として表示されます。 スケールバーは部位ごとのアミノ酸置換を表します。

'Ca. A. ニトラトレデューセンスの濃縮培養では、アルキルコハク酸シンターゼを利用してプロパンを活性化し、n-およびイソ-コハク酸プロピルを生成しました。 アセチルCoAは、炭素骨格の再配列、脱炭酸、ベータ酸化の後に生成されます。 アセチル-CoAのCO2への酸化は、酸化的トリカルボン酸サイクルまたはウッド-ユングダール逆経路に関与する酵素によって触媒されます（紫色のラベル）。 「Ca. A. nitratireducens は、脱窒に関与するすべての酵素 (NapAB、NorB、NosZ、NirS/K を除く) および DNRA プロセス (NapAB、NrfAH) (緑色のテキスト) を保持していました。 'Ca の正規化された遺伝子発現。 A. nitratireducens' は TPM (100 万あたりの総転写産物) として示されます。 線の太さが増加すると、遺伝子発現値が増加することを示します。 青、緑、紫、太字で標識された酵素はタンパク質抽出物中で完全または部分的に同定されましたが、赤い文字は酵素が検出されなかったことを示しています。 アルキルコハク酸シンターゼ、Ass; 長鎖アシルCoAシンテターゼ、FadD。 メチルマロニル CoA ムターゼ、Mcm; プロピオニル-CoA カルボキシラーゼ、Pcc; コハク酸-CoA リガーゼ、Suc; コハク酸デヒドロゲナーゼ、Sdh; トリカルボン酸、TCA; COデヒドロゲナーゼ:アセチルCoAシンターゼ、CODH/ACS; メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、Mthfd; メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、Mthfr; ホルミルテトラヒドロ葉酸デホルミラーゼ、Fthd; ギ酸脱水素酵素、Fdh。 F 型 H+ 輸送 ATPase、ATP。 NADH-キノンオキシドレダクターゼ、Nuo; 多成分 Na+ H+ 対向輸送体、Mnh; メナキノール、MKH2; メナキノン、MK; 硝酸還元酵素、昼寝。 シトクロム c 552 亜硝酸レダクターゼ、Nrf; 一酸化窒素還元酵素、Nor; 亜酸化窒素還元酵素、No.

メタトランスクリプトームおよびメタプロテオーム解析により、プロパンを完全に嫌気的に酸化して CO2 に酸化する提案された経路に関与する遺伝子が、Ca で高度に発現していることが明らかになりました。 A. nitratireducens」およびそれらの対応する遺伝子産物は、プロパン添加後のタンパク質抽出物でも検出されました（ホルミルテトラヒドロ葉酸デホルミラーゼとギ酸デヒドロゲナーゼは例外として、図5;補足データ2）。 A. ニトラティレデューセンスは、ステージ 1 とステージ 2 の両方で AOP において積極的な役割を果たしました。メタゲノム ライブラリー全体を検索したところ、ASS20,32 やアルキル補酵素 M レダクターゼ 22 の遺伝子など、AOP に関連する既知の遺伝子をコードするシステム内の他の集団は存在しないことが示唆されました。 、23。 共存する微生物集団の相対活性 (合計でトランスクリプトーム読み取り全体の 14 ～ 22% を占める) も、'Ca の相対活性よりも大幅に低かった。 A. nitratireducens ' (総トランスクリプトーム読み取りの 64 ～ 83%、図 3c)。 これらの結果は、「Ca.」を強く示唆しています。 A. nitratireducens' はシステム内の AOP の原因となっていました。

濃縮バイオマスからの細胞抽出物は、超高感度トリプル四重極質量分析法を使用して、活性化経路の主要な代謝産物について分析されました。 トータルイオンクロマトグラムは、コハク酸プロピル標準物質と抽出された代謝産物の保持時間が同一であることを示しました（補足図 12）。 コハク酸イソプロピル (m/z: 289 > 147.2) およびコハク酸プロピル (m/z: 289 > 147.1) 標準に対応する質量ピークが細胞抽出物で検出されました (図 4a、b)。 これらの発見は、「Ca」という仮説を裏付けています。 A. ニトラティレデューセンスは、一級炭素原子と二級炭素原子の両方でホモリティックな CH 結合開裂を通じてプロパンを活性化し、フマル酸塩を添加すると、コハク酸プロピルとコハク酸イソプロピルを生成します。 さらに、培養抽出物中にはコハク酸イソプロピル（5.96 nM）がコハク酸プロピル（2.33 nM）よりも豊富に含まれており、コハク酸イソプロピルを生成する二次炭素原子の活性化がプロパン酸化の主な経路であることが示唆されました（図5）。

'Ca. A. nitratireducens の MAG には、硝酸塩から亜硝酸塩への還元を触媒する硝酸還元酵素 (napAB) や、硝酸塩の亜硝酸塩への還元を触媒する硝酸還元酵素 (nrfAH) など、DNRA に必要なすべての遺伝子も含まれています (図 5、補足表 4)。亜硝酸塩をアンモニウムに生成します。 メタトランスクリプトームの結果から、napAB 遺伝子は 'Ca. によってコードされていることが明らかになりました。 A. ニトラティレデューセンスは、ステージ 2 と比較してステージ 1 でより高度に発現され、これはステージ 1 の硝酸塩濃度が高いことと一致しています (補足図 13a)。 さらに、「Ca. A. nitratireducens の nrfAH は、大量のアンモニウムが生成されるステージ 2 で高度に発現されました (補足図 13b)。 さらに、硝酸レダクターゼ（NapAB）およびシトクロムc亜硝酸レダクターゼ（NrfA）の触媒サブユニットもタンパク質抽出物中で同定されました（図5;補足表4）。 コミュニティの他のメンバーも異化性硝酸塩還元経路（脱窒およびDNRA;図3d）の遺伝子を発現していましたが、そのレベルは「Ca」と比較して大幅に低かったです。 A.ニトラレデューセンス。

'Ca.さんの寄稿閉じた代表的な MAG が識別可能な一酸化窒素を生成する亜硝酸レダクターゼ (nirS/K) を欠いていることを考えると、A. nitratireducens と窒素ガスの観察された生成との関係は完全には明らかではありません。 MAG には、脱窒の最後の 2 ステップに対する注釈付きの可能性があります。 一酸化窒素を窒素ガスに変換するための一酸化窒素レダクターゼ（norB）および亜酸化窒素レダクターゼ（nosZD）をコード化します（図5;補足表4）。 これらの遺伝子は両方の段階で高度に発現され、タンパク質抽出物で検出されました（補足表4）。これは、この微生物が一酸化窒素の二窒素ガスへの還元に寄与していることを示しています。 これらの観察は、「Ca. A. nitratireducens は、亜硝酸塩を一酸化窒素に還元するための新規遺伝子または新規経路を利用している可能性があります。 実際、Bacillus vireti やメチロトローフ細菌などの他のいくつかの微生物は、nirS/K 遺伝子を持たないにもかかわらず、一酸化窒素を生成することが報告されています 39,40,41。 また、観察された窒素ガスへの脱窒、または亜硝酸塩から一酸化窒素への還元に、コミュニティの他のメンバーが寄与している可能性もあります。 しかし、nirS / K遺伝子および他の脱窒遺伝子の発現は、他のすべての集団では比較的低く（図3d）、「Ca」が「Ca」であることを示唆しています。 A. nitratireducens' は、システム内の窒素と炭素の両方の変換の大部分を担っていました。

嫌気性プロパン酸化ファーミキュートの同定は、デルタプロテオバクテリアおよび古細菌門ハロバクテリオタのメンバーについて以前に示されている、環境中のSCGAの嫌気性酸化を媒介する微生物系統の既知の系統的多様性を拡大する。 我々の知る限り、この研究は硝酸塩依存性嫌気性プロパン酸化（n-DAPO）を媒介する微生物を同定した最初の研究である。 さまざまな自然および人工生態系における硝酸塩の蔓延と、石油および天然ガスの生産によるプロパンの大気排出量の増加42を考慮すると、これまで記載されていなかった n-DAPO プロセスが自然環境で発生する可能性が高く、地球規模の炭素と窒素の循環の間の見落とされている関連性を表しています。 。 新たに発見されたn-DAPOプロセスは、大気質と気候に対するプロパンの悪影響を軽減する上で重要な役割を果たす可能性があり、さらなる調査が必要である。 プロパンはメタンに比べて温室効果ガスとしては弱いですが、ヒドロキシルラジカルと反応してオゾンの生成量が増加する可能性があります9,43。 また、プロパンは、2 つの重大な大気汚染物質である NO2 と硝酸ペルオキシアセチルの生成にも寄与します43。 「Ca」の同定と特徴付け。 A. nitratireducens は、SCGA 排出の制御における微生物の役割のより良い理解に貢献します。

アルカニボラン (al.ka.ni.vo'rans。NL neut. n. alkanum、アルカン、L. pres.part. vorans、むさぼり食う、NL masc. n. Alkanivorans、アルカンを食べる人)。 nitratireducens (ni.tra.ti.re.du'cens。NL masc. n. nitras (gen. nitratis)、硝酸塩; L. pres. 部分。reducens、別の状態に変換する。NL 部分。adj. nitratireducens、還元する硝酸塩）。 この名前は、プロパンを消費し、窒素関連化合物を還元できる生物を意味します。

オーストラリアのブリスベンにある廃水処理プラントからの嫌気性消化汚泥と活性汚泥の混合物から濃縮されています。

嫌気性のプロパン酸化硝酸塩還元細菌。通常、約 0.5 (直径) × 1.5 μm (長さ) の桿菌形状の細胞として観察され、クラスターを形成することもあります。 温度と pH の点で中温性 (22 ～ 25 °C、pH 7 ～ 8 で濃縮)。

深海のガスの湧出や温泉の堆積物など、プロパンが豊富な環境の堆積物に簡単にアクセスできない場合、本格的な下水処理施設からの約 100 mL の嫌気性消化汚泥と 50 mL の活性汚泥の混合物（ブリスベン、オーストラリア）をバイオリアクター濃縮のための接種材料として使用しました。 廃水には通常、さまざまな微生物の増殖を可能にする幅広い有機基質が含まれています。 また、嫌気性消化システムでも少量のプロパンが生成される可能性があります44。 私たちは、そのような系にはプロパン酸化微生物が存在する可能性があると仮説を立てました。 接種材料を、前述のように調製した 1.84 L の無酸素合成培地を含む 2.3 L バイオリアクター内でインキュベートし 45、0.46 L のヘッドスペースを残しました。液体とヘッドスペースを純粋な溶媒で定期的にフラッシュすることにより、ヘッドスペース内のプロパン分圧を 0.9 ～ 1.4 atm の間に維持しました。プロパン ガス (99.99%、Coregas、オーストラリア)。 ヘリウムをヘッドスペースに手動で注入して、反応器を最大 1.5 気圧まで加圧しました。 硝酸塩は、濃縮ストック溶液（80 g NO3--N l-1）を手動で注入することによって反応器にパルス供給されました。 バイオリアクターをマグネチックスターラー (IKA、Labtek、オーストラリア) を使用して 400 rpm で連続的に混合し、室温 (22 ± 2 °C) でインキュベートしました。 １Ｍの無酸素性ＨＣｌ溶液を手動で添加することにより、ｐＨを７から７．５の間に制御した。 1 ～ 3 か月ごとに、200 mL の上清を新しい合成培地と交換しました。 液体サンプル (1 mL) をバイオリアクターのサンプリングポートを介して週に 2 ～ 3 回採取し、硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニウムの測定のために 0.22 μm フィルター (ポリエーテルスルホンフィルター、Millex、米国) で濾過しました。 プロパンおよび窒素ガスの測定のため、週に 2 ～ 3 回、気密シリンジ (Hamilton、USA) を使用してヘッドスペースからガスサンプル (100 μL) を採取しました。

硝酸塩の還元と嫌気性プロパン酸化の化学量論的測定のため、硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニウムに加えて、2.3 L バイオリアクターのヘッドスペース内のプロパンと窒素の濃度を 990 日目から 1000 日目まで定期的に測定しました。さらに、2 つのバッチ試験も実施されました。 2.3 L バイオリアクターから嫌気的に移された 500 mL バイオマスのサブサンプルを含む 650 mL ガラス容器 (補足表 5)。 次いで、バイオマスをアルゴンガス(99.99%、Coregas、オーストラリア)で20分間フラッシュして、液体中に溶解したプロパンを除去した。 約 45 mL のプロパンガスを唯一の電子供与体としてヘッドスペースに添加しました。 プロパンを含まない濃縮培養物、およびプロパンを含む滅菌合成培地を対照として設定しました（補足表5）。 各バッチ試験を３回繰り返して実施した。

同位体標識実験では、バイオリアクターからの 500 mL バイオマスのサブサンプルを嫌気的に 650 mL ガラス容器に移しました。 バイオマスを純粋なプロパンガス(99.99%、Coregas、オーストラリア)で20分間フラッシュした。 約 12 mL の 13C 標識プロパン (13CH313CH213CH3、99 原子 % 13C、Sigma) を隔壁を通してヘッドスペースに注入しました。 約 1% の 15N 標識硝酸ナトリウム (98 原子% 15N、Sigma) を含む約 1 mL の硝酸塩原液 (10 g NL-1) を加えて、濃度約 20 mg NL-1 を達成しました。 気密シリンジを使用して、ヘッドスペース (米国ハミルトン) からガスサンプルを定期的に採取し、ヘリウムでフラッシュしたバイアル (英国エクセテイナー) に注入しました。 液体サンプルを収集し、ろ過（0.22 μm）し、15NO3-、15NO2-、および 15NH4+ の分析まで -20 °C で保存しました。 液相で生成された CO2 を定量するために、ろ過されていないサンプルを Exetainer バイアルに注入し、1 M HCl 溶液で酸性化し、CO2 測定前に少なくとも 0.5 時間ヘッドスペースと平衡させました。

濾過したサンプル中の硝酸塩、亜硝酸塩およびアンモニウムの濃度は、Lachat QuickChem8000 フローインジェクション分析装置 (Lachat Instrument、ウィスコンシン州ミルウォーキー) を使用して測定しました。 ヘッドスペース内のプロパン、窒素、二酸化炭素の濃度は、熱伝導率検出器と Shincarbon ST 充填カラム (2 m × 2.0 mm) を備えたガスクロマトグラフ (GC、7890 A、Agilent、米国) で定量されました。 ガスクロマトグラフは、キャリアガスとしてアルゴンを使用して操作されました（流量、28 mL min-1）。 オーブン、インジェクター、検出器の温度はそれぞれ 220、250、260 °C に維持されました。 プロパン、窒素、二酸化炭素の濃度は外部標準曲線に基づいて計算されました。

硝酸塩と亜硝酸塩を含む同位体標識サンプルを 2 つの等しいサブサンプルに分割しました。 1 つのサブサンプルについて、硝酸塩および亜硝酸塩の 15N 画分を N2O46 に変換した後、Thermo Delta V 同位体比質量分析計 (IRMS) で測定しました。 他のサブサンプルについては、10% HCl47 中の 4% (wt/vol) スルファミン酸を使用して亜硝酸塩を除去し、残りの硝酸塩中の 15N 画分を IRMS で測定しました。 次に、亜硝酸塩中の 15N の割合を次の式を使用して計算しました: (NO3- + NO2-) 中の 15N 割合 × (NO3- + NO2-) の総量 = NO3- 中の 15N 割合 × NO3- の総量 + 中の 15N 割合NO2− × NO2−の総量。 微小拡散法 48,49 を使用して、アンモニウムが GF/D フィルター (Whatman、英国) に捕捉され、IRMS を使用した同位体分析のために燃焼されました。 ガスサンプル中の 29N2、30N2、13C 標識プロパンおよび 13CO2 は、四重極質量分析計 (5957 C inert MSD、Agilent、米国) に接続されたガスクロマトグラフ (7890 A、Agilent、米国) で測定されました。 ガスクロマトグラフには、J&W HP-PLOT Q PT カラム (30 m × 530 μm) が装備されており、キャリアガスとしてヘリウムを使用して操作されました (流量 5.58 mL/min)。 オーブンを 45 °C で 2 分間維持し、その後 10 °C/分の速度で 60 °C まで加熱し、そこで 6 分間保持しました。 N2、CO2、および C3H8 は、質量校正のための標準的な自動調整手順を使用して、70 eV 電子衝撃 (EI) で検出されました。 取得は、同定のためにトータルイオンクロマトグラフィー (TIC) で実行され、28、29 および 30 Da (N2)、44 および 45 Da (CO2)、44 および 47 Da ( C3H8)、各信号の滞留時間は 100 ミリ秒です。 データ処理は、Chemstation プログラム (Agilent、米国) を使用して実行されました。

バイオマスサンプル (10 mL) を濃縮バイオリアクターから 2 ～ 3 か月ごとに採取し、DNA 抽出のために遠心分離 (8000 × g、10 分間) によってペレット化しました。 DNAは、FastDNA SPIN for Soilキット(MP Biomedicals、USA)を製造業者のプロトコールに従って使用して抽出した。 DNA濃度は、Nanodrop分光光度計(Thermo Fisher Scientific、デラウェア州ウィルミントン)を使用して測定しました。 16 S rRNA 遺伝子 (V6 ～ V8 領域) のアンプリコン配列決定は、Illumina MiSeq プラットフォーム (Illumina、米国) でユニバーサル プライマー セット 926 F (5'-AAACTYAAAKGAATTGACGG-3') および 1392 R (5'-ACGGGCGGTGTGTRC-3')50 を使用して実行されました。 ）オーストラリアエコゲノミクスセンター（ACE、オーストラリア、ブリスベン）にて。 配列決定結果は QIIME250 を使用して処理されました。

1040 日目 (初期メタゲノムの場合) と 1100 日目 (浅いメタゲノムの場合) に抽出された DNA は、ACE の Illumina Nextera XT DNA ライブラリー調製キットと NextSeq500 (Illumina、USA) プラットフォームを使用して、ショートリード ペアエンド ライブラリーによって配列決定されました。 、メーカーのプロトコルに基づいています。 微生物群集が最初のメタゲノムと一致していることを確認するために、浅いメタゲノムシーケンスのサンプルもメタトランスクリプトミクスシーケンスのサンプルと同時に採取されました（補足図14）。 ライブラリは、初期メタゲノムと浅いメタゲノムでそれぞれ平均 1 億 4,900 万と 100 万のリードを生成しました (補足データ 1)。 生成されたリードの重複、アダプター、および品質の悪い塩基は、内部で FastQC (https://www.bioinformatics.babraham) を呼び出すパラメーター「–remove_dups–minlen 100」を指定した ReadTrim (https://github.com/jlli6t/ReadTrim) を使用して削除されました。 .ac.uk/projects/fastqc/)、FastUniq-1.151、cutadapt 2.10、および Trimmomatic-0.3652。

バッチ反応器からのバイオマス（1120日目）もNanoporeロングリードシーケンスに供した。 DNA は、Qiagen PowerSoil Pro キット (Qiagen、ドイツ) を使用して抽出され、Qubit Flex Fluorometer (Thermo Fisher Scientific、デラウェア州ウィルミントン) の Qubit 1x dsDNA HS アッセイ キットと QIAxcel DNA 高分解能キットの組み合わせを使用して品質チェックされました。 QIAxcel Advanced システム (Qiagen、ドイツ)。 ライブラリーの調製は製造業者のプロトコールに従って完了し、PromethION (Oxford Nanopore Technologies, USA) で配列決定されました。 ベースコールは Albacore (https://github.com/Albacore/albacore) を使用して実行され、Q5 を超える品質で 7,300 万回の読み取りが行われました。 そのうち、1,200 万リードは 1,000 bp より長く、リード N50 は 6,135 bp でした。 アダプターは、Porechop v0.2.4 (https://github.com/rrwick/Porechop) を使用してトリミングされました。

Aviary (https://github.com/rhysnewell/aviary) は、ハイブリッド アセンブリとショートリードとロングリードのビニングに使用され、内部でいくつかの異なるアセンブラーとビニング ツールを呼び出しました。 結果は Bandage53 を使用して手動でチェックされました。 結果のビンは、DASTools 1.1.254 を使用して整理されました。 復元されたゲノムは、デフォルト設定の drep-3.2.255 の「dereplicate」ワークフローを使用してさらに複製解除され、59 個の高品質ゲノムで構成される重複のないゲノム セットが得られました。 ゲノム情報の範囲およびその他の詳細は、IGV 2.11.156 を使用して表示および手動でチェックされました。 ゲノムの完全性と汚染は、CheckM v1.1.357 を使用してチェックされました。 品質をトリミングしたショートリードは、Bowtie 2.3.4.3 を使用して最終的な MAG セットとアンビニングされたコンティグにマッピングされました。 読み取り全体で整列された長さの比率が 75% 未満、または整列された領域の同一性が 97% 未満のマッピングは削除されました。 各 MAG の存在量は、高品質の一次マッピングのみを備えた CoverM 0.6.1 (https://github.com/wwood/CoverM) を使用してプロファイリングされました。 NGA50 およびその他のゲノム特性は、Python パッケージ BioSut (https://github.com/jlli6t/BioSut) を使用して計算されました。

すべての MAG とビン化されていないコンティグについて、オープン リーディング フレーム (ORF) が呼び出され、GTDB-Tk 分類から推定されたドメインを持つ Prokka 1.14.558 を使用してゲノムの一次アノテーションが実行されました。 KEGG Orthology HMM データベース (2021 年 7 月にアクセス) を kofamscan 1.3.059 を使用して検索し、e 値 <1e-10 および最大 F 値を持つ各遺伝子のトップヒットを選択しました。 UniRef10060 (2020 年 3 月にアクセス) は、NCBI 分類データベースでインデックス付けされ、diamond61 v2.0.11.149 を「blastp–sensitive」で使用して検索されました。 e-value <1e-5 および ID > 30 を持つトップヒットが選択され、KEGG Orthology データベースにマッピングされました。 EggNOG v5 データベースは、ダイヤモンド モードで emapper 2.1.5 を使用して検索されました。 プロパン酸化および窒素代謝に関連する予測遺伝子内に存在する保存モチーフは、NCBI の保存ドメイン検索を使用してさらに検証されました 62。 注釈付きの KO 番号は、各ゲノムにコードされている経路を推測するために使用されました。 合計ブロックが 5 を超える場合に欠落ブロックが 75% を超える場合、または総ブロック ≤ 5 の場合に欠落ブロックが 1 を超える場合、経路は「発現されていない」と識別されました。

ゲノム分類データベース (GTDB r202) を使用して細菌ゲノム ツリーを構築し、ゲノムから推定された 120 個の細菌特異的保存マーカー遺伝子の連結セットを使用して細菌ゲノムを回収しました。 簡単に言うと、ゲノム内のマーカー遺伝子は Prodigal 2.663 を使用して同定され、HMMER 3.364 を使用して整列されました。 ツリーは、WAG + GMMA モデルを備えた FastTree 2.1.1165 を使用して推論されました。 ブートストラップは、GenomeTreeTk v0.1.6 (https://github.com/dparks1134/GenomeTreeTk) を使用して 100 回のノンパラメトリック ブートストラップで実行されました。 樹木は ARB 6.0.666 を使用して視覚化し、さらに改良するために Adob​​e Illustrator (Adobe、USA) にインポートしました。 ゲノムの分類は、GTDB-Tk v1.5.167 の「classify_wf」ワークフローを使用して決定されました。

16S rRNA 遺伝子は、「Ca.」で同定されました。 A. nitratireducens の MAG およびデータベース内の公開されている Symbiobacteriia ゲノム。 これらの遺伝子を SILVA 138 SSU データベースと比較しました。 選択された配列および予測された 16S rRNA 遺伝子配列は、cd-hit 4.8.168 を使用して複製解除されました。 合計 112 個の 16S rRNA 配列が収集され、SSU-align v0.1.169 を使用してアラインメントされました。 系統樹は、「-gtr -gamma」パラメーターを指定した FastTree 2.1.1165 を使用して推論されました。

'CaのAssAの系統解析については。 A. nitratireducens'、700 アミノ酸より長い 24 個の参照 AssA および BssA タンパク質配列 (参照配列のアクセッション番号は補足表 6 に示されています) は公共データベースからダウンロードされ、パラメーター '-diags1 -マキターズ5'。 msa のギャップは、trimAI 1.4.171 を使用してトリミングされました。 系統樹は FastTree 2.1.1165 を使用して推論されました。 16S rRNA 遺伝子と AssA アミノ酸ツリーの両方の構築では、ブートストラップ値の計算とツリーの視覚化はゲノム ツリー構築に従って行われました。

１１００日目に、３つの６５０ｍＬガラス容器中で、各容器に５００ｍＬのバイオマスのサブサンプルを入れて、三重のバッチ試験を実施した。 バイオリアクターにおける硝酸塩の削減は 2 つの段階に分けられました。 ステージ 1 では、硝酸塩は主に亜硝酸塩と二窒素ガスに変換され、アンモニウムの生成はほとんどありませんでしたが、ステージ 2 ではアンモニウムと二窒素ガスの両方が生成されました。 全 RNA と DNA を共抽出するために、各段階の各バッチテストから 10 mL の活性濃縮培養物を収集し、RNAlater 溶液 (Sigma-Aldrich) を加えて保存し、室温で 1 時間放置しました。 次いで、混合物を滅菌硝酸セルロースフィルター（０．２０μｍ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ；ゲッティンゲン、ドイツ）を通して濾過した。 0.2 μm フィルターを通過する可能性のある微生物を捕捉するために、分子量カットオフ 100 K の Amicon® Ultra Filter (Sigma-Aldrich) を使用して濾液をさらに濃縮しました。 濃縮濾液および硝酸セルロースフィルター中の全 RNA および DNA次に、RNeasy Powersoil DNA 溶出キット (Qiagen、ドイツ) を備えた RNeasy Powersoil Total RNA キットを製造業者のプロトコールに従って使用して抽出しました。 Turbo DNA-free キット (Thermo Fisher Scientific、米国)、続いて RNA Clean & Concentrator-5 Kit (Zymo Research、米国) を使用して、RNA 抽出物から微量のゲノム DNA を除去しました。 Ribo-Zero Plus キットを使用した TruSeq Total RNA Library Prep を、メーカーのプロトコールに従って RNA ライブラリーの調製に使用しました。 ライブラリーは、ACE (オーストラリア、ブリスベン) の NextSeq500 (Illumina、USA) プラットフォームで 2 × 75 サイクルのペアエンドランで配列決定されました (表 S1)。

生成されたリードは、パラメータ「–remove_adap –minlen 60」を指定した ReadTrim (https://github.com/jlli6t/ReadTrim) を使用してトリミングされました。 rRNA データベースは、5SRNAdb72 からの古細菌および細菌の 5S rRNA、SILVA73 v138 からの SSU データベース、および SILVA v132 からの LSU データベースから構築されました。 リボソーム RNA 様リードは、デフォルト設定で SortMeRNA 4.2.074 を使用して削除され、データベースは上記のように構築されました。 品質トリミングされたリードは、bowtie2 を使用して、複製が解除された MAG セットとビン化されていないスキャフォールドにマッピングされました。 アラインメント長がリード長の 95% 未満、または同一性が 97% 未満のアラインメントは削除されました。 RNA ライブラリーの潜在的な DNA コンタミネーションは、dirseq (https://github.com/wwood/dirseq) の修正バージョンである RNAdir (https://github.com/jlli6t/RNAdir) を使用して特定されました。 次に、scipy.stats.binomtest 関数を使用して二項テストを実行しました。 マッピングは、TPM (100 万あたりの総転写産物) の計算に使用されました 75。 各ゲノムの総発現レベルは、各ゲノム内のすべてのコード配列の TPM の合計として計算されました。

タンパク質抽出の場合、トランスクリプトミクスバッチテストから収集した濃縮培養物 10 mL を遠心分離 (18,000 × g、4 °C) によってペレット化し、1 × PBS で洗浄し、分析まで -80 °C で保存しました。 細胞ペレットを 5% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) で溶解し、20 mM ジチオスレイトール (最終濃度) とともに 70 °C で 60 分間インキュベートした後、室温まで冷却し、続いて 40 mM ヨードアセトアミド (最終濃度) でアルキル化しました。 30分間暗闇。 その後、１．２％リン酸（最終濃度）および６容量のＳ－Ｔｒａｐ結合緩衝液（９０％メタノール、最終濃度１００ｍＭ重炭酸アンモニウム、ｐＨ７．１）を添加した。 製造業者のプロトコールに従って、全タンパク質を S-Trap Micro Spin Column (ProtiFi、Huntington、USA) で消化しました 76。 簡単に説明すると、タンパク質溶液を S-Trap フィルターにロードし、すべての溶液が通過するまで 4,000 g で遠心分離しました。 フィルターを150μLのS-Trap結合バッファーで3回洗浄し、1μgのシーケンシンググレードのトリプシンで47℃で1時間消化しました。 消化されたペプチドを、40μlの50mM重炭酸アンモニウム、0.1%ギ酸水溶液、50%アセトニトリルおよび0.1%ギ酸のH2O溶液を使用して連続的に溶出した。 ペプチド溶液を乾燥させた後、20μlの5%アセトニトリル水溶液に再懸濁した。 ペプチドは、Q-ExactiveTM HX Hybrid Quadrupole-OrbitrapTM 質量分析計 (Thermo ScientificTM) に接続された Dionex Ultimate 3000 RSLCnano-LC システムを使用した液体クロマトグラフィータンデム質量分析 (LC-MS/MS) によって分析されました。 生の配列決定データは、「Ca」の注釈付きメタゲノムに対して検索することによって処理されました。 Thermo Proteome Discoverer (バージョン 2.2.0.388) の A. nitratireducens 。 同定されたタンパク質には、誤検出率 (FDR、q 値) の厳密性カットオフが 0.05 未満である固有のペプチドが少なくとも 1 つ含まれていました。

代謝産物抽出物の調製のために、5 mL の濃縮培養物をバイオリアクターから収集しました。 細胞を遠心分離 (8000 × g、10 分、4 °C) によって回収し、溶解マトリックス チューブ (MP Biomedicals) 内の 1 mL アセトニトリル-メタノール-水 (4:4:2、vol/vol/vol) 混合物に再懸濁しました。 ）ガラスビーズ入り。 ビーズベースのホモジナイザーを使用して、ホモジナイズステップの間に氷上で冷却しながら（15秒）、低速（3000 rpm、50秒）で往復振盪を5サイクル操作して細胞を溶解しました。 抽出物を、4℃、18,000gで10分間の遠心分離によって細胞破片およびガラスビーズから分離し、分析まで-80℃で保存した。

カスタム合成した標準物質 (コハク酸プロピルおよびイソプロピル、ベスト オブ ケミカルズ、米国) および細胞抽出物を回転真空濃縮器 (コンセントレーター プラス、エッペンドルフ) で乾燥し、次に 20 μL 塩化メトキシアミン (ピリジン中 30 mg/ml) で誘導体化しました。 37 °C で 2 時間連続混合します。 次いで、１％トリメチルクロロシラン（ＴＭＣＳ）を含有するＮ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（ＢＳＴＦＡ、２０μＬ）を加えた。 サンプルを 37 °C で 30 分間連続振とうしながらインキュベートし、超高感度トリプル四重極 GC/MS-TQ8050 システム (島津製作所、日本) を使用して分析しました。 GC システムには EI イオン化源が装備されており、化合物の検出のために多重反応モニタリング (MRM) モードで操作されました。 ヘリウムをキャリアガスとして 1.0 mL/min の一定流量で使用しました。 誘導体化サンプル 1 マイクロリットルを、注入温度 280 °C のスプリット モード 1:10 で PTV インジェクターに注入しました。 分離は DB-5ms カラム (95% ポリジメチルシロキサン、30 m × 0.25 mm × 1 μm) (Agilent JW Scientific) で実行されました。 オーブンの温度は、最初は 120 °C で 1 分間保持され、次に 8 °C/min の速度で 220 °C まで上昇し、最後に 50 °C/min で 320 °C まで上昇して 1 分間保持されました。 イオン源の温度は 200 °C に設定しました。 特定の質量分析パラメーターは、各分析物の断片化イオンを監視するために各化合物に合わせて調整されました (補足表 7 を参照)。 EI イオン源からの 2 つのフラグメント イオンが指定され、衝突セルでさらにフラグメント化されました。 最も多く発生する 3 つの過渡現象が監視対象として選択されました。 Transient 1 は量指定子として使用され、他の 2 つは修飾子として使用されました。

FISH は基本的に Daims ら 77 によって詳述されたとおりに実行されました。 バイオリアクターからのバイオマスを 4% パラホルムアルデヒド (w/v) で固定し、PBS 中の 50% エタノール中に -20 °C で保存しました。 FISH プローブは、濃縮バイオリアクターから生成された関連配列を含む Silva SSU Ref NR99 データベース リリース 13873 に対して ARB ソフトウェア 70 を使用して設計されました。 データベース内に関連する配列が存在しない場合 (>92% の類似性)、プローブは 'Ca の 16 S 配列に対して設計されました。 A. nitratireducens は十分に特徴付けられたシステム以外に適用する場合には注意が必要です。 プローブ検証に利用できる培養代表物がないことを考慮して、Ca 上の異なる部位を標的とする 3 つの FISH プローブを設計しました。 A. nitratireducens の 16 S rRNA を使用すると、その特異性についてより高い信頼性が得られます。 これらには、SYMB-1018 (5’ - CCG AAG CCC AGC AAA CTC T - 3’)、SYMB-624 (5’- TTC GCA AGC ACT CCC GCA – 3’)、SYMB-186 (5’ - TCC TCC CGT CCC CAT GC – 3’) が含まれます。 ) プローブ。 非標識ヘルパー プローブ 78 は、各プローブ サイトの隣接領域をターゲットにして、最適な蛍光シグナルの標的部位へのアクセス性を高めるように設計されました (SYMB-1018: H1, 5’ - ATT TCT AGA GCG GTC AGG GGA TGT − 3’; H2, 5’ - CAC CTG TCT CCC TGT CTG GA − 3’; SYMB-624: H1, 5’ - GTT AAG CTG C​​GG GTT TTC ACT CAC − 3’; H2, 5’ - CTG C​​CC TCA AGC CCA ACA GT − 3’; SYMB-186: H1, 5’ - GGC CGT GAG CAT ATC CGG TAT TAG C − 3’; H2a, 5’ - GAC CCA TCC CGA AGC AGT AAA CCT T − 3’; H2b, 5’ - GAC CCA TCC CGA AGT AGC AAC CCT T − 3’）。 ヘルパープローブは、それぞれのプローブと等モル量で適用されました。 オリゴヌクレオチド FISH プローブの 5' および 3' 末端は Cy3 蛍光団で標識され、シンガポールの Integrated DNA Technologies によって合成されました。 室温で30分間バイオマスをリゾチーム前処理(0.05M EDTA、0.1M Tris-HCl、pH 8中0.5mg ml-1)することにより、これらのFISHプローブについてより高いシグナルが達成された。 非 EUB ナンセンス プローブは、ネガティブ ハイブリダイゼーション コントロールとして使用されました 79。 細胞の DAPI (1 ng/μl) 染色を暗所で 15 分間実行しました。 標識されたバイオマスは、Stellaris5 白色光レーザー共焦点顕微鏡 (Leica、ドイツ) で視覚化されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

シーケンス データは、プロジェクト番号 PRJNA802347 で NCBI データベースにアーカイブされます。 すべてのドラフトゲノムヌクレオチド配列は、アクセッション番号 SAMN25643198 から SAMN25643256 で NCBI に提出されています。 質量分析プロテオミクス データは、データセット識別子 PXD031366 で PRIDE パートナー リポジトリ経由で ProteomeXchange コンソーシアムに寄託されています。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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我々は、「Ca」の命名に関する提案について、A. Oren (エルサレムのヘブライ大学) に感謝します。 A. nitratireducens'、G. Talbo と L. Liu がタンパク質抽出とプロテオミクス データ分析を支援、Y. Wang と C. Lai がバイオリアクターの操作を支援、X. Zhang と S. Hu がガスクロマトグラフのメンテナンスを支援、N.化学分析については Clayton、N. Dawson、および J. Li、FISH プローブの最適化については A. Tabrett および A. McInnes、編集については E. Larsen が協力しました。 JL は UQ Research Training Scholarship によって支援されています。 JG、SM、GTはそれぞれオーストラリア研究評議会（ARC）Future Fellowships FT170100196、FT190100211、FT170100070の支援を受けています。 ZY は、ARC オーストラリア賞受賞者フェローシップ (FL170100086) によってサポートされています。

これらの著者は同様に貢献しました: Mengxiong Wu、Jie Li。

オーストラリア水・環境バイオテクノロジーセンター、クイーンズランド大学工学部、建築および情報技術学部、セントルシア、クイーンズランド州、オーストラリア

Mengxiong Wu、Jie Li、Zhiguo Yuan、Jianhua Guo

クイーンズランド工科大学 (QUT) 生物医科学部マイクロバイオーム研究センター、トランスレーショナル リサーチ インスティテュート、ウーロンガバ、クイーンズランド州、オーストラリア

アンディ・O・ルー、ジーン・W・タイソン、サイモン・J・マキロイ

サザンクロス大学理工学部沿岸生物地球化学研究センター、リズモア、ニューサウスウェールズ州、オーストラリア

ダーク V. 二等兵

メタボロミクス オーストラリア (クイーンズランド ノード)、オーストラリア生物工学およびナノテクノロジー研究所、クイーンズランド大学、セントルシア、QLD、4072、オーストラリア

テラ・スターク

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JGがこの研究を発案した。 MW、JG、SM が実験を計画しました。 MW はバイオリアクター内の微生物を濃縮し、質量と電子の平衡および同位体標識実験を実施しました。 DE は同位体窒素の測定を実施しました。 TS は、同位体炭素および代謝物の分析のためのメソッドをセットアップします。 SM は FISH プローブを設計し、FISH 顕微鏡検査を実施しました。 MW は、メタゲノミクス、メタトランスクリプトミクス、メタプロテオミクス シーケンスのために、サンプリング、保存、DNA、RNA、タンパク質の抽出を実行しました。 MW、JG、ZY はプロセスデータ分析を実行しました。 JLAL、MW、GT、SM、JGは微生物群集解析とバイオインフォマティクス解析を実施した。 MW、JL、ZY、SM、JG は、他の著者全員と相談して原稿を執筆しました。

サイモン・J・マキロイまたは郭建華との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Florin Musat ともう一人の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Wu、M.、Li、J.、Leu、AO 他。 シンバイオバクテリア綱内の系統による硝酸塩還元と結合したプロパンの嫌気性酸化。 Nat Commun 13、6115 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-33872-y

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受信日: 2022 年 4 月 12 日

受理日: 2022 年 10 月 5 日

公開日: 2022 年 10 月 17 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-33872-y

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