アンモニア酸化細菌と古細菌の硝化への寄与

Scientific Reports volume 12、記事番号: 19928 (2022) この記事を引用

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硝化は、農業生態系における N2O 放出の主要なプロセスの 1 つであると考えられており、土壌微生物によって制御され、主に土壌の pH、酸素含有量、NH4+ の利用可能性によって制御されます。 これまでの研究では、N2O生成に対するアンモニア酸化細菌（AOB）と古細菌（AOA）の相対的な寄与が土壌pHによって異なることが証明されているが、土壌pHによる硝化由来のN2O生成の調節機構についてはまだ合意が得られていない。 この研究では、1-オクチン (AOB の選択的阻害剤) とアセチレン (AOB および AOA の阻害剤) を小宇宙インキュベーション実験で使用し、中性 (pH = 6.75) での N2O 排出に対する AOA と AOB の相対的な寄与を区別しました。 ) およびアルカリ性 (pH = 8.35) の土壌。 我々は、アンモニウム (NH4+) の補正により、AOA および AOB に関連する N2O の両方の生成が観察的に刺激され、2 つの試験土壌における AOA および AOB のアンモニア モノオキシゲナーゼ (AMO) 遺伝子量が増加することを発見しました。 その中で、AOB はアルカリ性土壌におけるアンモニア酸化のプロセスを支配し、硝化に由来する N2O 生成の 70.8% に寄与しました。 対照的に、AOA と AOB の寄与は、酸性土壌における硝化関連 N2O のそれぞれ約 3 分の 1 を占めました。 結果は、pH が AOA と AOB の存在量と活性を変化させる重要な要素であり、紫色土壌における N2O 生成の誘導の区別につながることを示しました。 我々は、NH4+ 含有量と土壌 pH の両方がアンモニア酸化微生物の特殊化を媒介していると推測しています。 そして、特殊化の結果と N2O 収量の両方が、紫色の土壌における異なる N2O 放出特性につながりました。 これらの結果は、将来の N2O 削減戦略の開発に役立つ可能性があります。

N2O は、大気中の CO2 の 265 倍（100 年規模）の温暖化係数を持つ微量温室効果ガスであり、成層圏のオゾンを破壊する作用があります1。 2015 年の世界の大気中の N2O 濃度は 328.8 ppb で、産業革命以来 21% 増加しました2。 現在の割合での持続的な排出量は、現在の予測から 2030 年までさらに 18% 増加することになります3。 肥沃な農地土壌は、大量の N2O を大気中に排出するホットスポットであり、世界の大気中 N2O 排出量の約 60% を占めています4。 しかし、化学肥料の継続的な使用に伴い、食料、畜産、バイオマスエネルギーの需要が増大することは避けられません。 したがって、持続可能な農業のために N2O 排出を規制するための最適な対策を見つけるには、施肥土壌からの N2O 生成の原因となるメカニズムを理解することが特に重要です。

農業生態系では、N2O は土壌微生物による硝化と脱窒によって生成され 5,6、いくつかの非生物的プロセスもその一部に寄与しています 7。 硝化は、適切な土壌酸素含有量の下での主要な N2O 生成プロセスです。 アンモニア酸化（すなわち、NH3 が中間生成物 NH2OH を介して NO2- に酸化される）は、硝化の主要かつ律速段階であると考えられています。 アンモニア酸化古細菌 (AOA) とアンモニア酸化細菌 (AOB) は両方とも、N2O の生成を引き起こすアンモニア酸化の遺伝的潜在能力を持っています8,9。 AOB は、NH2OH の NO10 への不完全な酸化によって、あるいは NO2- から NO と N2O11 への還元の硝化脱窒を制御することによって、中間体として機能する N2O を生成する可能性があります。 対照的に、AOA によって生成される N2O は、純粋培養および濃縮培養で従来検出されている複数のプロセスに起因しますが、土壌中での AOA 酵素触媒反応による N2O の生成を裏付ける明確な証拠はこれまでありませんでした 12。 さらに、アンモニア酸化機能ギルドの 1 つとして機能する、新たに発見され広く普及している完全アンモニア酸化剤 (comammox) は、N2O 排出への影響については依然として不確実であるが、一部の研究では、AOB よりも小さな役割しか果たしていないことが示唆されている13,14。

硝化抑制剤は、NH4+-N から NO3-N への変換を軽減し、窒素の利用効率を向上させるために農業土壌に広く適用されてきました15。 AOA と AOB の両方のアンモニア酸化剤における重要な機能酵素の 1 つは、N2O 合成プロセスを直接触媒するアンモニア モノオキシゲナーゼ (AMO) です。 アセチレン (C2H2) は AMO の非選択的硝化阻害剤であるため、低濃度 (0.1 ～ 10 Pa) で AOA と AOB の両方のアンモニア酸化を阻害します 16,17。 一方、1-オクチンは土壌中の AOB 活性を阻害できるが、AOA は阻害できない選択的阻害剤であり、硝化に対する AOB と AOA の相対的な寄与を区別するために使用できます 18、19、20、21。

実質的な研究により、土壌の種類や環境要因を含む多くの要因が、AOA と AOB の存在量、活性、N2O 放出に対する相対的な寄与、特に土壌の pH と無機窒素 (N) の供給量を決定することがわかっています 22,23,24。 例えば、アンモニウム濃度が豊富な土壌では AOB の存在量と活性が増加しましたが、AOA は影響を受けず、または阻害されませんでした 16,18。 無肥料土壌または酸性土壌では、AOA の存在量と活性は AOB よりもはるかに高くなります 25,26。 Wang et al.21 は、酸性 (pH = 6) とアルカリ性 (pH = 8) の耕作可能な土壌の両方で抑制剤の方法を使用した場合、窒素肥料による N2O 排出は AOB で 70.5 ～ 78.1%、AOA で 18.7 ～ 19.7% に起因すると報告しています。中国の。 同様に、Yang et al.27 は、阻害剤の方法を使用して、アルカリ性土壌では AOB が重要な微生物の役割を担っており、硝化関連 N2O の約 85% に寄与しているのに対し、酸性土壌では硝化関連 N2O の 78% が AOA によって寄与されていることを発見しました。 。 さらに、N2O 排出に対する AOB と AOA の相対的な寄与も、適用される合成物質の種類と量によって規制されます。Hink ら 24 は、アンモニアを大量に添加すると AOB からの N2O の生成が刺激されるが、アンモニア供給が少ない場合には AOA が優勢であることを発見しました。 しかし、Fu ら 28 は、酸性 (pH = 5.5) およびアルカリ性 (pH = 7.9) 土壌の両方において、N を適用しない処理における N2O 排出に対する AOB の相対的な寄与が、アンモニウム N 添加処理よりも大きいことを示しました。アルカリ性土壌への尿素N添加処理。

N2O 排出に対する AOA と AOB の相対的な寄与と影響因子については多くの研究が調査されているが、AOA と AOB の空間的および時間的不均一性を伴う AOA と AOB の存在量変化と N2O 収量の複雑なメカニズムのため、多様性を説明するメカニズムについてはコンセンサスが存在していない。環境条件と土壌の性質。 長江上流流域の山岳地帯の紫土の農地への多量の窒素肥料施用によって引き起こされるかなりの N2O 排出源 29,30 のため、「」という戦略目標を達成するには、N2O 排出を軽減するための具体的な対策を提案することが不可欠である。この地域では炭素削減」が重要です。 そこで、我々は、新たに開発した阻害剤1-オクチンと分子生物学的手法を用いて、2つの対照的な紫色の土壌で小宇宙インキュベーション実験を実施し、異なる土壌におけるN2O生成、収量、およびAOAとAOBに関連する遺伝子量に影響を与える要因を評価しました。 目的は、アンモニア酸化プロセスのメカニズムをより深く理解し、農業における低排出技術の開発を促進することです。

2020年9月、中国科学院紫土塩亭農業生態ステーション（N 31）の長期施肥実験区（5 m × 1.5 m、各試験土壌の3つの区画）から2つの試験表層土壌サンプルが収集されました。 °16'、東経 105°28' ）、中国の長江上流の四川盆地中央に位置します。 平均気温は 17.3 °C、年間平均降水量は 863 mm で、その約 70% が 5 月から 9 月にこの場所で発生します。 そこでの作付体系は夏トウモロコシと冬小麦の輪作であり、N-P2O5-K2O をトウモロコシに 150-90-36 kg ha-1、小麦に 130-90-36 kg ha-1 でそれぞれ施用した。

中性土壌（pH = 6.75、以下 SX と名付けます）とアルカリ性土壌（pH = 8.35、以下 PL と名付けます）を含む 2 つの試験土壌を、異なる風化度を持つ紫がかった砂岩の同様の母岩から配合し、耐久年数は 50 年未満です。土壌形成以来 31,32。 これらは、中国南西部の重要な穀物生産地域であり、中国人口の 10% 以上を養う長江上流流域の丘陵地帯の主な土壌タイプです。

土壌オーガーを使用して 2 つの試験表層土壌 (0 ～ 15 cm) を収集し、プロットの長手方向の中心線に沿って 2 メートル間隔で配置した 3 つのコアをプールし、各プロットで均質化しました。 植物の根と残骸を除去した後、すべての土壌を 2 mm のふるいにかけ、次に 2 つの部分に分けました。 一部は土壌水分含有量と基本的な物理的および化学的特性の測定に使用され、土壌の残りの部分はインキュベーション実験まで 4 °C で保管されました。 2 つの土壌の基本的な物理的および化学的特性を表 1 に示します。

N2O 放出に対するさまざまなアンモニア酸化プロセスの相対的な寄与を区別するために、アンモニア酸化剤 (つまり AOB と AOA) の相互作用をブロックする選択的阻害剤としてアセチレンと 1-オクチンを採用しました。 インキュベーション実験は、18 g (乾燥重量) の土壌が入ったブチルゴム栓付きの 250 ml 血清ボトル内で実施されました。 土壌微生物の活動を安定させるために、新鮮な土壌を 250 ml 血清ボトル内で 25 °C で 7 日間プレインキュベートしました。 プレインキュベーション後、土壌を滅菌水のみ（対照、窒素添加なし）または無機窒素溶液（100 mg NH4Cl-N または KNO3-N g-1 土壌重量）で補正した後、60% WFPS に調整しました。 次に、ボトルを蓋で覆い、汲み出した空気の一部を、Taylor et al.20 に従い、事前に調製したアンモニア酸化抑制剤のアセチレン (Ace、0.01%、v/v) または 1-オクチン (Oct、5 μM 水溶液) に置き換えました。 ）。 合計 9 回の処理 (3 回の反復) が次のように実施されました。

N フリー (N および阻害剤を含まない)

Nフリー＋エース（Nフリー、アセチレン0.01％）

N フリー + Oct (N なし、5 μM 1-オクチン)

NH4+ (100 mg g-1 NH4Cl-N、阻害剤なし)

NH4+ + Ace (100 mg g-1 NH4Cl-N および 0.01% アセチレン)

NH4+ + Oct (100 mg g-1 NH4Cl-N および 5 μM 1-オクチン)

NO3- (100 mg g-1 KNO3-N および阻害剤なし)

NO3− + Ace (100 mg g−1 KNO3-N および 0.01% アセチレン)

NO3− + Oct (100 mg g−1 KNO3-N および 5 μM 1-オクチン)

すべての処理は 25 °C で 21 日間実施されました。 この期間中、酸素条件は、２日ごとに通気し、アセチレン（０．０１％ｖ／ｖ）および１－オクチン（５μＭ水溶液）を添加することによって阻害環境を再確立することによって維持された。 阻害剤を含まない土壌からの N2O 放出は、硝化 (AOB および AOA の寄与を含む)、脱窒、および非生物的プロセスによって寄与されました。 アセチレンは AOA と AOB の両方のアンモニア酸化を抑制できるため、AOA と AOB からの N2O 排出量は、「NH4+ + Ace」（「NO3− + Ace」または「Ace」）処理での N2O 排出量を、処理で測定された値から差し引くことによって計算されました。 「NH4+」（「NO3−」または「Nフリー」）処理。 1-オクチンは AOB の増殖のみを特異的に阻害するため、AOA からの N2O 排出量は、「NH4+ + Ace」（「NO3- + Ace」または「Ace」）処理での N2O 排出量を「NH4+ + 処理」で測定した値から差し引くことによって計算されました。 Oct」（「NO3− + Oct」または「Oct」）治療。 AOB からの N2O 排出量は、AOA と AOB の値から AOA を差し引くことによって計算されました。

インキュベーション全体を通じて、0、1、2、3、5、7、11、14、18、および 21 日目に 20 ml のヘッドスペースガスサンプルをシリンジ (トリプルバルブ付き) で収集し、N2O 排出濃度をガスで測定しました。 N2O 濃度用の 63Ni 電子捕獲検出器を備えたクロマトグラフ (Agilent 7890B、米国)。 ガス測定値は、既知の濃度の混合ガス (混合標準ガス中の 440 ppb N2O) を使用して校正されました。 培養した土壌を 0、7、14、21 日目に破壊的にサンプリングしました。 土壌サンプルは 2 つの部分に分割され、一部は土壌の NH4+-N および NO3--N の含有量を測定するために 4 °C で保管されました。 別の部分は DNA 抽出のために -80 °C に保たれました。 NH4+-N および NO3-N の土壌内容物を 2 M KCl 溶液 (土壌: 溶液 = 1:5 w/v) で抽出し、1 時間振盪した後、0.45 μm フィルター膜で濾過しました。 抽出物は連続フロー分析装置 (Auto Analyzer 3、SEAL Analytical、ドイツ) によって分析されました。

培養前と培養 21 日後に採取した土壌サンプルを DNA 抽出に使用しました。これは、培養 21 日後には N2O 放出量が安定しているためです。 メーカーの説明書に従って、DNeasy PowerSoil DNA Isolation kit (QIAGEN, Germany) を使用して DNA を抽出するために、0.5 g の湿った土壌を使用しました。 抽出された DNA の長さは 1% アガロースゲル電気泳動によってチェックされ、濃度と適格性は NanoDrop ND-1000 分光光度計 (Nano Drop Technologies、米国デラウェア州ウィルミントン) によって測定されました。 また、A260/280 と A260/230 の比は、それぞれ 1.5 ～ 1.9 と 0.7 ～ 1.0 の範囲でした。 精製された DNA 濃度は 10.8 ～ 36.8 ng/μL の範囲で変化しました。 amoA 遺伝子分析の定量的 PCR のために、土壌 DNA サンプルを -80 °C で保存しました。

3 つの生物学的複製によるすべての処理の AOB および AOA amoA 遺伝子は、ABI 9700 リアルタイム定量的蛍光 PCR (Applied Biosystem, America) を使用して増幅および定量されました。 AOB amoA 増幅プライマーの配列は、amoA-1F (5'-GGGTTTCTACTGGTGGT-3')/amoA-2R (5'-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3')33 であり、ArchamoAF (5'-TAATGGTCTGGCTTAGACG-3')/ArchamoAR (5') でした。 -GCGGCCATCCATCTGTATGT-3')34 を使用して、AOA amoA 遺伝子を増幅および定量しました。 各 20 μl 反応系には、10 μl GoTaq qPCR Master Mix (SYBR Premix Ex TaqTM)、0.5 μl の各プライマー (10 mM)、2 μl 10 倍希釈 DNA テンプレート、および 7 μl 滅菌純水が含まれていました。 AOB および AOA の増幅反応条件は次のとおりです: 95 °C で 3 分間の初期変性、95 °C で 30 秒の変性を 40 サイクル、55 °C で 34 秒のアニーリング、および 72 °C で 32 秒の伸長データ収集のために 72 °C で 5 分間伸長します。 AOA および AOB amoA 遺伝子の存在量を定量するために使用した標準曲線は、既知の濃度で AOA および AOB プラスミド DNA を 10 倍段階希釈することによって得られました (この研究では 5 つのポイントが 10-3 ～ 10-7 を形成します)。 増幅産物の特異性をチェックするために使用した融解曲線分析により、AOB および AOA amoA の増幅効率が 92 ～ 98% の範囲であり、標準曲線の相関係数 (R2) が AOB および AOA amoA 遺伝子について 0.994 および 0.998 であることが示されました。 、 それぞれ。

N2O フラックスは式 1 を使用して計算されました。 (1):

ここで、F (ng N g−1 d−1) は N2O 排出速度です。 T0 (237 K) は標準大気状態での温度です。 T (°C) は血清ボトル内の気温です。 V (L) はヘッドスペースの体積です。 V0 (22.41 × 10–3 m3) は標準大気状態でのモル体積です。 M (28 g mol−1) は、N2O 分子内の N の分子量です。 m (18 g) は、セラムボトル内のオーブンで乾燥させた土壌の重量です。 dc/dt は、単位間隔 (t) あたりの N2O 濃度 (c) の変化です。 24 は 1 日の時間数、K は次元換算係数です。

硝化による N2O 放出に対する AOA と AOB の相対的な寄与は、式 (1) と 2) を使用して計算されました。 (2)～(4)：

ここで、「N2O排出量の合計」は、21日間のインキュベーション後の阻害剤添加なしの処理による累積N2O生産量であった。 「その他による N2O 排出量」は、21 日間のインキュベーション後の他のプロセスの累積 N2O 生成量でした。

AOA、AOB などの N2O 収率は、式 1 を使用して計算されました。 (5):

ここで、x は AOA、AOB などです。「N2O 排出量(x)」および「NO3- 生成量」は、21 日間の培養期間全体にわたる N2O および硝酸塩の累積値であり、「N2O 排出量(x)」および「NO3- 生成量」の単位です。 「生成されるN」はmg N kg−1です。

統計分析は SPSS 24.0 ソフトウェア (SPSS Inc.、米国) を使用して実行され、この研究のデータは平均 ± 標準誤差として表されました。 異なる治療間の差異は、Tukey の多重範囲検定後の ANOVA によって、5% レベルの最小有意差によって検定されました。 2 つの土壌間の N2O 収量の統計分析のために、独立サンプルの t 検定を実行しました。 累積Ｎ２Ｏ排出量とＡＯＢまたはＡＯＡのａｍｏＡ遺伝子コピーとの間のピアソン相関を計算した。 図は、Origin 9.4 ソフトウェア (Origin Lab Corporation、ノーザンプトン、米国) を使用して作成されました。

「NH4+」処理の交換可能な NH4+-N 濃度は、SX および PL 土壌では最初の週に 104 mg/kg の値から 41 mg/kg の値に、および 107 mg/kg から 31 mg/kg の値に急速に減少しました。それぞれ。 そして、その後の 2 週間で減少速度は遅くなりました (図 1a2、b2)。 「NH4+」処理とは対照的に、1-オクチンは交換可能なNH4+-N濃度の減少を効果的に抑制し、2つの土壌の両方でより遅い減少速度を示しました。 「NH4+ + Ace」処理に関しては、NH4+ の変換は完全に抑制され、明らかな減少傾向は検出されませんでした。 NH4+ を添加しない処理では、インキュベーション全体を通じて低レベルの交換可能な NH4+-N 濃度が維持され、阻害剤の適用の有無にかかわらず、これらの処理では有意差はありませんでした（P > 0.05; 図 1a1、a3、b1、b3）。

「NH4+」処理における交換可能NH4+-N濃度の減少に応じて、交換可能NO3-N濃度は増加しました（図1c2、d2）。 予想どおり、2 つの土壌における「NH4+ + Oct」処理では、存在する 1-オクチンが交換可能な NO3-N の形成を部分的に阻害し、「NH4+ + Ace」処理ではアセチレンが NH4+-N の NO3-N への変換をほぼ完全に阻害しました。 NH4+ を添加しない処理に関しては、阻害剤の適用の有無にかかわらず、明らかな差はありません (P > 0.05; 図 1c1、c3、d1、d3)。

N2Oフラックスの変化傾向は土壌の種類によって異なりました。 NH4+のみを添加した処理は、インキュベーション初日に明確なN2Oピーク（SXおよびPL実験土壌でそれぞれ7および33ng N g-1d-1）を示し、翌日には急速に減少します（図2a2、図2a2、図2a2、図2a2、図2a2、図2a2、図2a2、図2a2、 b2)。 アセチレンの添加は、培養全体を通じて 2 つの土壌の「NH4+ + Ace」処理における N2O 生成の減少に顕著な効果を示し、AOA と AOB が好気性および 60% WFPS 実験条件における非生物的および脱窒プロセスよりも多くの N2O 排出に寄与することを示しています。 。 アセチレンの添加と比較して、1-オクチンは 2 つの土壌の「NH4+ + Oct」における N2O 排出に対し、同様ではあるがわずかながら N2O 排出を抑制します。これは、異なる硝化抑制剤が予想どおり N2O 排出の軽減において選択的抑制効果を持っていることを示しています (図 2a2)。 、b2)。 NH4+ 添加処理を除いて、結果はまた、NO3-N の有無にかかわらず、21 日間のインキュベーション期間中、阻害剤の存在の有無に関係なく、N2O 排出量に有意な差が見られないことも明らかにしています (P > 0.05)。 また、NH4+ を添加しないこれらの処理では発光ピークはなく、フラックスはインキュベーションの終了まで周期的な変動を示します (図 2a1、a3、b1、b3)。

蓄積された N2O 排出量は、土壌の種類、窒素肥料および阻害剤の種類によって異なりました (図 2c1 ～ c3、d1 ～ d3)。 「NH4+」処理では、残りの処理よりも有意に多くのN2O蓄積排出量が、インキュベーション終了時のSXおよびPL実験土壌でそれぞれ14および45μg N kg-1乾燥土壌に達しました（P < 0.05;表S1）。 。 NH4+ 添加を 1-オクチンとともに使用した場合、N2O 蓄積排出量は、SX および PL 実験土壌でそれぞれ 24.1% および 72.0% 劇的に減少し、アセチレン添加によるより強力な抑制は、相対的に 80.3% および 92.4% 減少しました。 「NH4+」トリートメントへ。 NO3 添加および窒素肥料添加なしの処理に関しては、阻害剤の有無にかかわらず、培養終了時に 2 つの試験土壌に有意差はありませんでした (P > 0.05; 表 S1)。

N2O収率(%)は、式(1)によって計算される、全21日間の培養期間にわたる土壌中の単位硝酸塩含有量あたりのN2O生成率として定義されました。 (5)。 結果は、異なるアンモニア酸化プロセスにおけるN2Oの収量が、NH4+の添加条件下で土壌の種類によって変化することを示しました(図3)。 PL 土壌中の AOB の N2O 収量は 0.22% で、SX の N2O 収量（0.03%）よりも有意に高かった（P < 0.01）。AOA によって誘導された N2O 収量にも同様の有意差が見られました（P < 0.05）。 しかし、他のプロセス (非生物誘導または脱窒誘導) では、SX 土壌の N2O 収量は PL 土壌の N2O 収量よりも有意に高かった (P < 0.05)。 NH4+ を添加した同じ土壌条件下では、異なる誘導プロセスによって N2O 収量が変化しました。PL 土壌では、AOB によって誘導された N2O 収量は、AOA および他のプロセスによって誘導された N2O 収量よりも有意に高かった (P < 0.01)。 しかし、SX 土壌では、他のプロセスによって誘導された N2O 収量は、AOA および AOB によって誘導された N2O 収量よりも有意に高かった (P < 0.01)。

N2O 生成に対する AOA と AOB の相対的な寄与は、両方の土壌で NH4+ 補正を行った土壌タイプとは大きく異なりました (図 4)。 PL 土壌では、オクチン感受性 (AOB) の N2O 蓄積生成物の割合は、オクチン耐性 (AOA) よりもはるかに高かった。 また、SX 土壌では、AOB 生成の割合が AOA およびその他の土壌よりわずかに高かった。 詳細には、SX土壌におけるAOB、AOAおよびその他のプロセスのN2O排出割合は、それぞれ36.1%、33.2%、30.7%でした。 関連する AOB、AOA およびその他の寄与率は、PL 土壌中でそれぞれ 70.8%、21.4%、および 8.9% です。

インキュベーションの開始時に、AOB amoA 遺伝子の存在量は、SX 土壌と PL 土壌でそれぞれ乾燥土壌あたり 1.65 × 105 コピーと 1.62 × 106 コピー g-1 でした（図 5a、b）。また、異なる処理でも培養開始時に同じ存在量を示します。インキュベーション。 NH4+補正はAOB amoA遺伝子の増加を有意に刺激し、培養21日目にSXおよびPL土壌でそれぞれ3.38×105および3.58×106コピーg-1に達した（P<0.01;図5a、b）。 。 窒素肥料や阻害剤が 2 つの土壌の両方に適用されたかどうかに関係なく、インキュベーション全体を通じて他の処理間で AOB amoA 遺伝子の存在量に明らかな差はありません。

AOA amoA 遺伝子に関しては、培養開始時の AOA amoA 遺伝子存在量は、乾燥土壌で SX 土壌および PL 土壌でそれぞれ 1.23 × 107 コピー g−1 および 8.35 × 106 コピー g−1 であった。 アンモニアと1-オクチンで補正すると、2つの土壌でAOA amoA遺伝子の量が他の処理よりも観察的に増加しました（P <0.01;図5c、d）。 AOB の阻害剤として選択された 1-オクチンの存在は、AOB amoA 遺伝子の増殖に対する効果的な抑制を示さず、逆に、2 つの試験土壌における AOA amoA 遺伝子の豊富さに対するプラスの刺激として作用しました。 阻害剤を適用した、または適用しなかった水または NO3 補正による処理は、インキュベーション全体を通じて AOA amoA 遺伝子の存在量を有意に変化させませんでした (P > 0.05)。

非生物的プロセスおよび硝化、脱窒を含む生物的プロセスは、多数の報告から、耕作可能な土壌で N2O を生成する主要なプロセスであると考えられています 7,35,36。 これは、AOBを特異的に阻害するために1-オクチンを使用した、中国南西部の紫色の土壌の異なるpHにおけるAOAとAOBから生じるアンモニア酸化とN2O収率の相対的な寄与を初めて区別するものである。 この研究では、テストした 2 つの農地土壌からの N2O 排出が、以下の点に基づいて硝化および無視できないその他のプロセスによって引き起こされていることを検証しました。 (1) NH4+-N 添加処理において、NH4+-N は急速に NO3-N に変化します。そして、インキュベーション中にNO3-Nが安定したままであるNO3-N添加処理よりもはるかに高いN2O生成をもたらしました（図1）。 (2) 両方の試験土壌は、以前の研究 6 によれば、アンモニア酸化による最適な N2O 生成である好気条件および 60% WFPS 条件下で実施されました。 また、従属栄養性脱窒装置からの N2O 排出量はごくわずかでした 24。 (3) それにもかかわらず、AOA および AOB を含む NH3 酸化剤の成長と活性が阻害された場合、アセチレン処理された小宇宙では N2O がゆっくりとではあるが無視できない量で蓄積し、他のプロセス (従属栄養性硝化や非生物的プロセスなど) によって引き起こされる N2O 放出もまた、割り当て可能な影響を保持していることを示しています。特に中性土壌では、他のプロセスが孵化中の総 N2O 排出量の 30.7% に寄与します (表 S1 および図 4)。

異なる N 肥料 (N フリー、アンモニウム N、硝酸 N) と組み合わせた場合の NH4+-N 含有量 (a1 ～ a3、b1 ～ b3) および NO3−–N 含有量 (c1 ～ c3、d1 ～ d3) のダイナミクスSX および PL 土壌のインキュベーション中の空気 (阻害剤なし)、アセチレンおよび 1-オクチン、エラーバーは 3 つの生物学的複製の標準誤差を表します。

多くの研究により、耕作可能な土壌における N2O 排出量は、土壌水分、土壌 pH などの複数の環境要因、および N 適用、耕作、その他の土壌管理処理を含む管理要因によって規制されていることが確認されています 37,38,39。 土壌の pH は、N2O 生成に影響を与える AOA と AOB の存在量の変化を制御する重要なパラメーターです40。 私たちの研究では、NH4+-N添加条件でアルカリ性土壌ではAOBがAOAよりも多くのN2O蓄積放出に寄与しており、アルカリ性土壌ではAOBが硝化プロセスを支配していることが示されましたが、AOAとAOBの両方が寄与した中性土壌では有意な差は観察されませんでした。 N2O 総排出量のほぼ 3 分の 1 に相当します (図 4 および表 S1)。 我々は、AOB が高 pH 土壌におけるアンモニア酸化において AOA より重要な役割を果たすことを発見し、これまでの報告を裏付けています 21、22、41、42。 考えられる説明の 1 つは、pH が高い土壌では NH4+-N から利用可能な NH3 への変換速度が加速され、アンモニア酸化剤の個体数と活性に影響を与える 27 のに対し、土壌 pH43 が低い場合は細菌の増殖がおそらく妨げられるということです。

明らかに、NH4+ を含む試験土壌は、AOA と AOB の両方により、対照と比較してさまざまな程度で N2O 生成を刺激しました (図 2 および表 S1)。 そして、これらの結果は、インキュベーション終了時の amoA 遺伝子量の AOA および AOB の顕著な増加によっても確認されました (図 5)。 現時点では、土壌中での AOA と AOB の異なる成長と活性についての最良の説明は、NH344 に対する親和性が大きく異なることです、45、46。 例えば、NH4+-N 濃度が高い土壌は AOB の成長を促進します 16,20 が、NH4+-N が低い土壌によって促進される AOA 活性は、NH4+-N が高いこの条件では制限されるか影響を受けない可能性があります 47,48。 私たちの研究では、2 つの試験土壌の対照における AOA amoA 存在量は増加しましたが、有意ではありませんでした。これは、AOA がアンモニア肥沃度の低い土壌で有機窒素を使用して増殖できることを示しています 22,49。 予想外なことに、高NH4+-N濃度とAOBが1-オクチンによって阻害されたこの条件でもAOAが増殖することがわかりました。これは、AOA amoA存在量の大幅な増加がこの点を証明したためであり、これはいくつかの以前の研究とは異なりました（図5c、d）。 21、28。 そして、この結果は、AOB が 1-オクチンによって阻害された場合、高濃度の NH4+-N 濃度下では、NH3 に関して AOA と AOB の間で直接競合があったのに対し、NH4+ -N が減少すると AOA の成長は継続し、AOB の成長は停止したという最近の報告と一致しました。検出不能24,50。

SX (a および c) で 21 日間インキュベートした後の、空気 (阻害剤なし)、アセチレンおよび 1-オクチンと組み合わせたさまざまな窒素肥料 (窒素フリー、アンモニウム窒素、硝酸態窒素) による N2O 排出フラックスと蓄積フラックス。 PL (b および d) 土壌、誤差バーは 3 つの生物学的複製の標準誤差を表します。

NH4+-N を肥料として供給した場合、AOB が NH3 酸化プロセスを支配し、N2O 収率は 0.03 ～ 0.22% の範囲でしたが、土壌の種類によって異なりました (図 3)。 中性土壌では、AOB によって誘発される N2O 収量 (~0.03%) は、NH4+ を含む土壌スラリーから得られた修正実験 51 の範囲値 (0.02 ～ 0.09%) 内に収まりました。 アルカリ性土壌では、AOB の N2O 収量がより高く (0.22%)、これは土壌 AOB 群集で優勢な土壌ニトロソスピラ系統 52 の純粋培養の結果と同様です 53。 AOA に関しては、NH4+-N を添加した場合、2 つの試験土壌における N2O 収量は 0.02% ～ 0.04% であり、これらの収量は Hink らによって以前に報告された 0.035% の値と同様であり、栽培された土壌の収量よりわずかに低い値です。土壌 AOA (0.08% ～ 0.23%)12,54,55。 これらの結果は、アルカリ性土壌と中性土壌の両方で N2O を生成するプロセスにおいて、AOB が AOA よりも高い N2O 収量を持つ可能性を示唆しました。 AOB の N2O 収率が AOA よりも高いことは、現在の認識によって説明できます。AOB での N2O 生成には 2 つの酵素機構 (つまり、硝化脱窒と不完全な NH2OH 酸化) があったのに対し、AOA には重要な酵素である既知の NO レダクターゼが欠けているようです。 NO を N2O に還元する56,57,58。 したがって、AOB の N2O 生成は生物プロセスとして知られていましたが、AOA による誘導は生物と非生物のハイブリッド形成によく似ていました 59。

NH4+補正処理におけるアンモニア酸化に伴うN2Oの収率。 バーの上の異なる文字は有意差を示し、同じ文字は有意差がないことを示し、エラーバーは 3 つの生物学的複製の標準誤差を表します。

さらに、硝化抑制剤の添加方法には、AOA と AOB21 の相対的な N2O 放出を区別する有効性にも限界があります。 1-オクチンは、試験土壌におけるAOB活性とamoA存在量の効果的な選択的阻害剤であり、NH4+-N添加処理ではAOBが土壌N2O生成に対して主導的な役割を果たしているが、AOAのamoA存在量は2つの両方でAOBの数倍を示していることがわかりました。土壌（図4および5）。 アセチレンは、AOA と AOB の両方の生物的アンモニア酸化の活性をブロックするために使用される非選択的阻害剤として機能しましたが、他のプロセス (従属栄養性硝化や非生物的プロセスなど) による蓄積された N2O 生成は、蓄積されたアンモニアの総量に顕著な規模で寄与しました。 N2O の生成 (図 4)。 N2O につながる他のプロセスの根本的なメカニズムを明らかにするために、同位体標識などの追加の調査が将来実施される必要があります。

21 日間のインキュベーション後のアンモニア補正処理を行った 2 つの土壌からの AOA および AOB の N2O 生成に対する相対的な寄与。 エラーバーは、3 つの生物学的複製の標準誤差を表します。

AOB および AOA amoA 遺伝子は、SX (a および c) および PL (b および d) 土壌での培養 0 日および 21 日目に豊富に存在します。 バーの上の異なる文字は有意差を示し、同じ文字は有意差がないことを示し、エラーバーは 3 つの生物学的複製の標準誤差を表します。

現在、硝化抑制剤 60、緩効性肥料 61,62,63、適切な肥料施用時期 61,64、不耕起 65,66 が、肥料使用効率を高め、N2O 排出を抑制するための主な戦略と考えられています。 我々の結果は、AOA と AOB のさまざまな N2O 収量を伴うアンモニア酸化の特殊化の影響を評価し、中国の長江上流の丘陵地帯の紫色土壌における N2O 排出量を軽減するための潜在的な戦略を提供します。 好気条件下で土壌の pH が上昇すると、N2O の累積生産量と N2O 収量 (特に AOB) が大幅に増加することから、pH の低下が N2O 排出量を減少させる可能性があることが示されました。 さらに、適度な硝化抑制剤の適用は、N2O 排出を軽減し、この領域での硝酸塩浸出のリスクを軽減する可能性があり、この観点は最近のレビューによって裏付けられています 67。 全体として、アンモニアの酸化を直接防ぐか、特殊化を変更して間接的に AOA による NH3 酸化の優位性を高める対策は、この領域での N2O 生成を減少させます。 一方、作物の収量、対策の実現可能性、コストについては、N2O 排出量の削減から得られる環境デューデリジェンスを考慮して検討する必要があります。

結論として、我々は、異なる pH 値の紫色の土壌において、選択された AOB 阻害剤を使用して、N2O 排出に対するアンモニア酸化細菌と古細菌の相対的な寄与を調査しました。 結果は、中性土壌とアルカリ性土壌の両方において、60%WHC土壌水分および好気条件下では、アンモニア酸化はAOAよりもAOBによって支配されることを実証した。 NH4+-N の供給により AOB の N2O 生成が大幅に増加しましたが、この条件で AOB 活性が阻害されると AOA 関連の N2O 生成も増加しました。 pH は AOA と AOB の存在量の変化を媒介する重要な要素として機能し、N2O 生成は土壌の pH の違いによって異なります。 これらの結果は、将来の N2O 削減戦略の開発に役立つ可能性があります。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された論文とその補足情報ファイルに含まれています。

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この研究は、中国国家科学財団の主要プロジェクト (U20A20107) および中国国家自然科学財団 (41301266) によって支援されました。

中国科学院山岳災害環境研究所、山岳表面プロセスと生態学的規制の主要研究室、#9、ブロック 4、人民南路路、成都市、610041、四川省、中国

Lei Hu、Zhixin Dong、Bo Zhu

中国科学院大学、北京、100049、中国

レイ・フー

中国科学院地理科学天然資源研究所、北京、100101、中国

王鄭

成都理工大学、成都、610059、中国

リーウェイ・シャオ

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LH と BZ は実験を設計しました。 LH、ZW、LX は作業のためのデータの取得と分析に参加しました。 LHが原稿を書きました。 ZD と BZ は、重要な知的内容について批判的に改訂しました。 すべての著者が投稿を承認しました。

ボー・ジュへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Hu, L.、Dong, Z.、Wang, Z. 他アルカリ性および中性紫色の土壌における硝化依存性の N2O 放出に対するアンモニア酸化細菌と古細菌の寄与。 Sci Rep 12、19928 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-23084-1

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受信日: 2022 年 6 月 14 日

受理日: 2022 年 10 月 25 日

公開日: 2022 年 11 月 19 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-23084-1

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