河口および沿岸水域における硝化およびそれに伴う亜酸化窒素排出に対する酸性化の影響

Nature Communications volume 14、記事番号: 1380 (2023) この記事を引用

4559 アクセス

25 オルトメトリック

メトリクスの詳細

大気中の二酸化炭素 (CO2) レベルの増加に伴い、陸地由来の栄養塩の流入、沿岸の湧昇、および複雑な生物地球化学的プロセスにより、河口および沿岸水域の酸性化が大幅に悪化しています。したがって、硝化剤が酸性化の激化にどのように反応するかをより深く理解することは、河口および沿岸生態系の反応と地球規模の気候変動への寄与を予測するために重要です。今回我々は、酸性化により硝化速度が大幅に低下するものの、河口水域や沿岸水域では副産物である亜酸化窒素（N2O）の生成が促進される可能性があることを示す。 CO2 濃度と pH を独立して変化させることにより、硝化剤の活性に対する CO2 上昇による予期される有益な効果 (「CO2 肥料」効果) が酸性化下では排除されます。メタトランスクリプトームデータはさらに、硝化因子が酸性化ストレスに対処するために細胞内 pH 恒常性に関連する遺伝子発現を大幅に上方制御できることを示しています。この研究は、硝化とそれに伴う温室効果ガスN2O排出に対する酸性化の影響の分子基盤を明らかにし、気候変動と人間の活動下での河口および沿岸生態系の反応と進化を予測するのに役立ちます。

大気中の二酸化炭素 (CO2) は、化石燃料の燃焼、セメント生産、森林伐採、その他の土地利用の変化などの集中的な人間活動により増加しています1。世界の平均大気中 CO2 濃度は現在 413.2 ppm に達しており、21 世紀末までに 800 ppm を超えると予想されています2,3。工業化時代に排出された CO2 の約 40% は海洋に吸収され 4、その結果、表層海水の pH 単位が約 0.1 単位低下します 5,6。今世紀末には pH がさらに 0.2 ～ 0.3 単位低下すると推定されており、敏感な生物や生態系に深刻な影響が予想されます 6,7,8。

河口および沿岸の生態系は、川、陸地、海洋の相互作用の下にある動的な領域9であり、人間の幸福に不可欠な生態系サービスを提供することができます10。しかし、大気中のCO2レベルの増加に伴い、河口および沿岸水域は、陸地由来の栄養塩投入、沿岸湧昇、および複雑な生物地球化学プロセスの相乗効果により、外洋よりも急激な酸性化に悩まされています（補足図1）。 11、12。世界中の河口および沿岸生態系に対する最大の脅威の 1 つは、流域の人為的栄養素の過剰投入です10。富栄養化によって引き起こされる植物プランクトンの生産は、藻類由来の物質が沈殿する底層水での高い呼吸速度をもたらす可能性があり、それが大量の CO2 生成を引き起こす可能性があります 13。したがって、河口および沿岸水域の酸性化は、高 CO2 湧昇水の突発的な侵入によって大幅に強化される可能性があり 11,13,14、これは河口および沿岸生態系の生物学的プロセスや機能に悪影響を与える可能性があります 15,16,17,18,19,20,21 。

硝化は、還元窒素プールと酸化窒素プールのバランスにとって重要なプロセスであり、無機化を脱窒および嫌気性アンモニウム酸化の窒素除去経路に結び付けます22。したがって、特に富栄養化した水生生態系において、地球規模の窒素循環において重要な役割を果たしています。硝化剤の成長は遅く、環境変動に対する感受性が高いため 23、硝化は水中の酸性化によって妨げられると予想されます。酸性化に対する硝化剤の反応における複雑な問題の 1 つは、CO2 分圧 (pCO2) の増加と pH の低下が相反する影響を与える可能性があることです。炭素源の増加は化学合成独立栄養性硝化因子（CO2 肥料）の成長を促進する可能性があるため、より高い pCO2 条件は硝化に利益をもたらすことが期待されます 24、25、26、27。対照的に、それに伴う pH の低下は、アンモニア (NH3) とアンモニウム (NH4+) の間の平衡を、アンモニア酸化剤に利用可能な基質 NH3 の濃度が低くなる方向にシフトさせ、それによって硝化を阻害する可能性があります 25,28,29。したがって、硝化剤の反応は、これらの潜在的なプラス効果とマイナス効果のバランスに大きく依存します。しかし、水中の酸性化の予測レベルが硝化剤の代謝に及ぼす影響やその根底にあるメカニズムについてはほとんど知られていません。

硝化は、温室効果ガスである亜酸化窒素 (N2O) 30、31、32、33 の生成の重要な経路でもあります。N2O は、モルあたりの放射力が CO2 よりも 300 倍以上強く、成層圏でオゾンと反応する可能性があります 34。 N2O は、ヒドロキシルアミン (NH2OH) から N2O への変換を介してアンモニア酸化細菌 (AOB) によって酵素的に生成されます 35,36。最近、シトクロム P460 を介した AOB による NH2OH から N2O への生物的変換も特徴づけられました 36。対照的に、アンモニア酸化古細菌 (AOA) による NH3 酸化に伴う N2O の放出は、主に NH2OH と NO2- または NO32,37,38 との間の非生物的反応に起因すると考えられています。以前の研究では、好気性の NH3 酸化中に AOA が生成する N2O の収率が AOB よりも低いことが示唆されています 37,39。さらに、完全アンモニア酸化剤（comammox）は、N2O が comammox 細菌による NH2OH の非生物的変換に由来するため、AOB よりも低い N2O 収率を示すことが文書化されています 40,41。しかし、硝化剤 N2O の生成が水中の酸性化にどのように反応するかはまだ明らかではありません。

今回我々は、水質の酸性化が長江河口と隣接する沿岸水域の硝化速度とそれに伴うN2O排出量にどのような影響を与えるかを調査する。 pCO2 の上昇と pH の低下による個々の影響を分離するために、操作実験も行われます。メタトランスクリプトームはさらに分析され、酸性化応答性遺伝子の発現を追跡することで硝化微生物の代謝応答を解明します。この研究は、酸性化と硝化の間の機構的相互作用についての洞察を提供し、河口および沿岸生態系の将来の生態学的進化を予測するのに役立ちます。

異なる酸性化レベル（pH 0.10〜1.05低下）は、長江河口沿いの6つの代表的な場所（Yz1〜Yz6）および隣接する沿岸水域から収集された、異なる空気：CO2ガス混合物の泡立つ水サンプルによって達成されました（図1、補足表1）および2）。これらの部位の硝化率は酸性化に対して同一の反応を示しました。高 CO2 の潜在的な有益な効果に関係なく、pH が低下するとすべてが著しく減少しました（補足図 2）。 pH が 7.92 ～ 8.15 から 7.80 ～ 8.04 に低下した場合でも、硝化率の低下 (5.8 ～ 18.1%) が検出されました (pCO2 は 122 ～ 172 μatm 増加) (P < 0.05)。 pCO2 が 2 倍になると、硝化率は約 11.1 ～ 34.1% 減少しました (P < 0.05)。構築された酸性化反応曲線に基づくと、硝化率の低下は水のpHの低下と強く相関していました（P < 0.05）（図2a）。硝化率は、過去数十年にわたって世界中の河口および沿岸水域で観察されてきた約0.21 pH単位の平均低下の下で約7.7〜25.0％減少します（補足図1）。硝化速度に対する酸性化のこの抑制効果は、外洋で以前に観察されたものと一致しています 28,42。ナラガンセット湾では、硝化率が pH の自然勾配の減少に伴って増加することが報告されていますが 43、これは酸性化単独の影響ではなく、生物地球化学的条件の組み合わせによるものである可能性があります。

駅は赤い星でマークされています。

a 硝化速度。データは、周囲対照と比較した酸性処理における硝化率の変化率を示しています。すべてのラインについて、P < 0.05。 b N2O 生成率。データは、周囲対照と比較した酸性化処理における N2O 生成速度の変化率を示しています。すべてのラインについて、P < 0.05。エラーバーは標準偏差 (n = 3 の生物学的に独立したサンプル) を表します。 ΔpH は、酸性化前後の水の pH の減少に対応します。フィッティング曲線は多項式フィッティング法により求めた。近似された曲線の方程式と P 値は補足表 3 に示されています。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

酸性化による硝化速度の阻害は、アンモニア酸化コミュニティがAOAによって支配されていた隣接する沿岸地域よりも、AOBが支配的なアンモニア酸化剤であった河口上水域で低い傾向がありました（図2aおよび補足図3）。。硝化微生物群集の不均一性に加えて、硝化速度に対する酸性化の影響のこの変動は、複数の生物地球化学的要因に起因する可能性があります43。特に、河口上流の NH4+ 濃度が比較的高いと、酸性化によって引き起こされるアンモニア酸化に対する阻害効果が緩和される可能性があります (補足表 1)。一貫して、河口および沿岸水域で測定された酸性化による硝化速度の阻害は、pH 0.1 単位の低下に応じて硝化速度が 3 ～ 44% 低下すると報告されている貧栄養海よりも一般的に低かった 28,42。実際、NH4+濃度は、河口から外洋に至るまでのさまざまな生息地における硝化速度に対する酸性化の抑制効果と負の相関がありました（ P < 0.05）28、42、44（補足図4）。それにもかかわらず、人間活動による富栄養化と大気中の CO2 レベルの上昇の相乗効果により、河口および沿岸水域の酸性化がより迅速かつ継続的に悪化していることを考慮すると、硝化速度の乱れは河口および沿岸の生態系プロセスに深刻な影響を与える可能性があります。

硝化率の応答に基づいて、参考文献。 28 人らは、海洋酸性化の結果としての硝化率の低下により、外洋での N2O 生成が大幅に減少する可能性があると推測しました。しかし、水の酸性化が N2O 生成に及ぼす影響は、硝化速度への影響とは切り離されている可能性があります 45。たとえば、参考文献。 42 は最近、北太平洋西部の海水の pH が低下すると、N2O 生成が大幅に増加する一方、硝化率は安定するか、さらには低下することを報告しました。しかし、彼らの研究では、強酸 (HCl) を添加することによって酸性化が操作されました。 HCl の添加により pCO2 が上昇し、pH が低下する可能性がありますが、アルカリ度も変化し、将来予想される炭酸塩パラメータと比較して異なる炭酸塩パラメータが生じます。つまり、溶存無機炭素 (DIC) は、自然の水酸性化下では変化しないのではなく増加します 46。さらに、N2O 生成のメカニズムが硝化生物ごとに異なるため、多様な水生生息地における硝化群集は酸性化に対して異なる反応を示す可能性があります 32,38,40。したがって、河口および沿岸水域の水酸性化に対する硝化中の N2O 生成の応答を評価する必要があります。

進行中の水中の酸性化を最もよく模倣できる、さまざまな CO2 レベルの滅菌空気による曝気を通じて 47、すべてのサンプリング場所での N2O の生成率が酸性化によって大幅に向上することがわかりました（補足図 5）。 pH が約 0.1 単位低下した場合でも (7.92 ～ 8.15 から 7.80 ～ 8.04)、インキュベーション終了時に N2O 生成の有意な促進 (8.4 ～ 23.1%) が観察されました (P < 0.05)。酸性化 - 反応曲線は、pHの低下とN2O放出の間で構築され、酸性化レベルの増加とともにN2O生成速度の大幅な増加が示されました（P < 0.05）（図2b）。世界中の河口および沿岸地域で検出された pH 単位の平均約 0.21 低下の下では、硝化中の N2O 生成率は約 9.5 ～ 27.5% 増加する可能性があります (図 2b)。これらの発見は、低酸素や有毒物質への曝露などの他の環境撹乱と同様に、AOB と AOA のどちらが優勢であるかに関係なく、酸性化により河口水域および沿岸水域での N2O 生成が増加する可能性があるという私たちの仮説を裏付けています。したがって、N2O 生成のメカニズムは硝化生物によって異なりますが 32、38、40、それらの N2O 生成速度は pH 低下下で増加する可能性があります。河口および沿岸水域の酸性化条件下での N2O 生成の増加は、北太平洋西部の場合と一致しています42。ただし、参考文献。 44 は、冷温帯および極地の海水における海洋酸性化による N2O 生成の阻害を文書化しました。彼らの研究では硝化が主な N2O 生成経路であると仮定すると、酸性化に対する N2O 生成の反応は極海では異なることになります。従属栄養性脱窒剤も N2O の生成に寄与している可能性がありますが、N2O の天然同位体特徴は、NO2 還元経路 (硝化剤脱窒と従属栄養性脱窒を含む) が放出された窒素酸化物の 0 ～ 13.3% しか寄与していないことが示されているため、その寄与は重要ではない可能性があります。 N2O (補足表 4)。さらに、すべての研究現場からのサンプルは十分に酸素化されていました [溶存酸素 (DO): 8.30 ～ 9.86 mg L-1。補足表 1]、インキュベーション中は高い DO レベルを維持しました (補足表 2)。これは従属栄養性脱窒では起こりそうにありませんでした。以前の研究では、DO 濃度が 0.06 mg L-1 を超えると、従属栄養性脱窒による N2O 生成が完全に阻害されることが報告されています 49。したがって、N2O の生成に対する脱窒細菌の寄与は無視できるはずです。この研究は、AOB主体の硝化装置とAOA主体の硝化装置の両方の硝化中のN2O生成が酸性化によって刺激される可能性があることを示しており、これは複雑で動的な河口および沿岸生態系における進行中の酸性化がN2O排出に及ぼす影響を評価するための重要なステップである。私たちの結果が代表的なものであり、硝化剤が世界の河口および沿岸のN2O排出量の半分に寄与していると仮定すると50,51（補足図6および補足表5）、これらの生態系における硝化由来のN2O排出量は0.05〜0.15 Tg N2O-N yr増加することになる。これは、世界の人為的 N2O 総排出量の 0.7 ～ 2.2% を占めます (6.9 Tg N2O-N yr-1)52。

私たちの結果は、酸性化は硝化速度を抑制するが、河口および沿岸水域での N2O 排出を増加させる可能性があることを示しました (図 2)。ただし、pCO2 の増加と pH の低下は、硝化剤に対して相反する影響を与える可能性があります。 pCO2 の上昇と pH の低下による個々の影響を区別するために、一連のオープン連続フロー小宇宙システムが構築されました。炭酸塩の化学的性質は、リアルタイムpH検出器に従って滅菌酸または塩基溶液でpH（7.8および8.1）を調整しながら、サイトYz3から収集した水サンプルをCO2調整空気（400μatmおよび800μatm）で着実にバブリングさせることによって操作されました（補足図）。 7）。平衡状態は 4 つのシナリオで達成されました [低 pCO2 (400 μatm) および高 pH (8.1)。低 pCO2 (400 μatm) および低 pH (7.8)。高い pCO2 (800 μatm) と低い pH (7.8)。高 pCO2 (800 μatm) および高 pH (8.1)]、インキュベーション期間中安定したままでした (補足表 6)。結果は、pCO2レベルとは無関係に、低pHでは硝化率が大幅に低下することを示し（図3a）、硝化率に対するpH低下の負の影響を実証しました。しかし、硝化に利益をもたらすと期待されるpCO2の上昇の影響は、pHに依存しているようです（図3a）。 pHを周囲温度8.1に維持すると、高いpCO2で硝化速度が増加するため、明らかな「CO2肥料」効果が観察されました（図3a）。対照的に、酸性化条件（pH 7.8）下では、pCO2の上昇により硝化速度の予想外の低下が引き起こされました（図3a）。このパターンは、関連する硝化剤の代謝プロセスが pH 低下の影響を受けると、pCO2 の増加が追加的なストレス要因になることを示唆しています。これらの結果は、低 pH 条件下で高 pCO2 の恩恵を受ける可能性がある N2 固定シアノバクテリアの観察とは対照的です 53。

a 硝化速度。 b 硝化中の N2O 生成速度。 4 つのシナリオが構築されました: 周囲対照 (400 μatm/pH 8.1、青色の実線バー)、酸性化グループ (800 μatm/pH 7.8、赤色の実線バー)、pH のみの低下 (400 μatm/pH 7.8、赤色の白抜きバー) 、pCO2 のみの増加 (800 μatm/pH 8.1、青色の白抜きバー)。列の上の異なる小文字 (a、b、c、および d) は、4 つのシナリオ間の有意な違いを示します (P < 0.05)。エラーバーは標準偏差 (n = 3 の生物学的に独立したサンプル) を表し、点は反復の対応するデータポイントです。有意差は、一元配置分散分析 (ANOVA) によって決定されました。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

硝化中のN2O生成は、酸性化条件下で、低下したpHと上昇したpCO2（図3b）の両方によって促進されました（図2b）。この条件は硝化装置にとって有益であったため（CO2施肥、図3a）、周囲のpHを維持しながら高pCO2下でN2O生成が促進されることは予想外でした（図3b）。硝化率の増加に伴い、副生成物 N2O の生成も増加する可能性があります。しかし、この可能性は、N2O生成速度の促進が硝化速度よりも大幅に高かったため、pCO2のみが上昇した条件（pCO2 800μatm / pH 8.1）でのN2O放出の増加を完全に説明することはできません（図3）。自然の酸性化条件（pH 低下に伴う pCO2 の上昇）では、pH 低下と pCO2 上昇の効果が組み合わさった場合、N2O 排出の最も強力な促進が期待されます（図 3b）。これは、酸性化した水生環境における硝化速度およびそれに伴う N2O 排出に対する pCO2 の上昇と pH の低下の個々の影響を切り離す初めての試みであり、硝化剤に影響を与える水中の酸性化の根本的なメカニズムについての洞察を提供します。それらの個々の効果は、当社が構築した連続気流および自動 pH インキュベーションシステムに基づいて首尾よく区別されました。 pCO2 レベルの増加は、化学合成独立栄養性硝化因子の活性にプラスの効果を引き起こす可能性があると以前に推測されました 54。対照的に、酸性化条件下では、pCO2 の上昇により硝化速度がさらに阻害され、望ましくない副生成物 N2O の放出が促進される可能性があります。したがって、微生物の窒素変換に対する水の酸性化の悪影響と、それらの地球規模の気候変動へのフィードバックは、おそらく以前に考えられていたよりも強力です（補足図8）。

酸性化ストレスに対する重要な分子応答として、硝化剤は細胞内シグナル伝達ネットワークによって遺伝子発現を調整する可能性があり 55、これは硝化速度の低下と N2O 生成の増加にさらに反映される可能性があります。しかし、水中の酸性化に対する硝化群集の転写応答は不明のままです。メタトランスクリプトーム配列決定は、酸性条件下での硝化コミュニティの生理学的代謝に関与する遺伝子の差次的発現を調査するために使用できます 23。しかし、短期間の酸性化実験に基づいてメタトランスクリプトームを取得するという以前の試みは失敗に終わりました。これは、mRNA の極度の不安定性と環境サンプルの複雑さが原因である可能性がある、良好な完全性と純度を備えた十分な mRNA がなかったためです。さらに重要なことは、硝化剤は、河口および沿岸水域の複雑な微生物群集のほんの一部しか占めていないため（<5％、補足図9）、そのため、硝化剤の生理学的代謝を完全に明らかにするのに十分な硝化転写物を抽出することは困難です。したがって、長期の酸性化を模倣し、硝化剤を濃縮するために、サイト Yz3 からの水サンプルを使用した一連の連続流環境シミュレーターがセットアップされました。周囲対照におけるｐＨおよびｐＣＯ２は、それぞれ約８．１および４００μａｔｍに維持されたが、酸性化処理においては、それぞれ約７．８および８００μａｔｍで安定した。〜25日後、連続運転シミュレーターは安定した硝化反応（補足図10）と硝化コミュニティの優位性（周囲対照および酸性化処理でそれぞれ44.6％と45.5％を占める）を示しました（補足図11、12）。。現場の硝化細菌は同時に濃縮され、環境中の元のメンバー (ニトロソモナスとニトロスピラ) が優勢なままでした。しかし、AOA の細胞数は硝化濃縮液ではあまり増加しなかったため、硝化菌を阻害するためにストレプトマイシンを加えて AOA 培養をさらに行いました。 50日間のインキュベーション後、AOAの相対存在量は1.1％から11.2％に増加しましたが、硝化細菌は検出できませんでした（補足図13）。これらの硝化富化培養物では、酸性化処理で硝化率の大幅な低下とN2O放出の刺激が観察され（補足図14、15）、このパターンは野外水サンプルのパターンと一致しました。濃縮操作は元の環境微生物群集を変化させますが、硝化濃縮は、複雑な河口および沿岸水域における酸性化に対する硝化剤の転写反応を調査するための代表的なものです。

メタトランスクリプトーム分析 (補足表 7) によると、窒素変換、サイトゾルの pH 恒常性、エネルギー生成、および CO2 固定に関与する遺伝子はすべて、CO2 誘発性の酸性化が転写レベルで硝化因子の生理学的代謝に大きく影響する可能性があります。酸性化（図4a～c、5a～c）。 AOBのアンモニアモノオキシゲナーゼ遺伝子の潜在的に活性なサブユニット（amoA）の発現は、酸性化処理により66％下方制御されました（図4a）。リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）でも、細菌性 amoA 遺伝子の発現が酸性化条件下で有意に下方制御されることが実証されました（P < 0.01;補足表9）。一貫して、細菌のamoB（アンモニアモノオキシゲナーゼサブユニットB、触媒サブユニットとしても示唆されています56）とamoC（アンモニアモノオキシゲナーゼサブユニットC）の発現は、酸性化後にそれぞれ68％と69％減少しました（図4c）。さらに、ヒドロキシルアミンデヒドロゲナーゼ遺伝子 (hao) の発現は 61% (P < 0.01) ダウンレギュレートされましたが、亜硝酸酸化還元酵素遺伝子 nxrA と nxrB の発現はそれぞれ 76 % と 61% (P < 0.01) 減少しました。酸性化条件（図4cおよび補足表9）。 AOAの転写データに基づいて、古細菌amoAの発現も酸性化条件下で下方制御されました（P < 0.05）（図5aおよび補足表9）。さらに、古細菌amoCの転写物は43％ダウンレギュレートされましたが、古細菌amoBの発現は酸性化下でも変化しませんでした（図5c）。全体として、NH3の硝酸塩（NO3-）への段階的な酸化に関与する機能的遺伝子転写物は、酸性化条件下では一般に下方制御され、硝化速度の低下と一致しました（図2a）。

a 硝化細菌の NH3 の段階的酸化 (NH3 → NH2OH → NO → NO2- → NO3-)、N2O 生成、エネルギー生成、および細胞質ゾル pH 恒常性に関与する遺伝子の発現に対する酸性化の影響を示す概略モデル。最近発見されたコマンモックスニトロスピラを除いて、亜硝酸塩の酸化はアンモニアの酸化と同じ生物内では起こらないことが多いため、膜は点線で破られています。相対的な遺伝子発現の変化倍数 (FC) は、酸性化サンプルを周囲対照と比較することによって計算されました。ローマ数字は、呼吸鎖内の酵素複合体 I (NADH デヒドロゲナーゼ)、複合体 III (シトクロム bc1 複合体)、複合体 IV (シトクロム C オキシダーゼ)、および複合体 V (ATP シンターゼ) を指します。青い点線の矢印は電子の動きを示しています。 E、未知の酵素。 b カルビンおよび還元的トリカルボン酸 (rTCA) サイクルを介した CO2 固定に関与する遺伝子の発現に対する酸性化の影響。タンパク質のピクトグラムの中心の色は、これらのタンパク質をコードする遺伝子転写物のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションの程度を示します。タンパク質のピクトグラムの周囲の色は、(c) のバーの色に対応します。 c (a) および (b) に示すタンパク質をコードする転写物の FC。略語の定義は補足表 8 に示されています。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

a NH3 酸化、N2O 生成、エネルギー生成、および AOA の細胞質 pH 恒常性に関与する遺伝子の発現に対する酸性化の影響を示す概略モデル。相対的な遺伝子発現の変化倍数 (FC) は、酸性化サンプルを周囲対照と比較することによって計算されました。ローマ数字は、呼吸鎖内の酵素複合体 I (NADH デヒドロゲナーゼ)、複合体 III (b-pcy)、複合体 IV (pcy-aa3)、および複合体 V (ATP シンターゼ) を指します。青い点線の矢印は電子の動きを示しています。 b 3-ヒドロキシプロピオン酸/4-ヒドロキシ酪酸サイクルに関与する遺伝子の発現に対する酸性化の影響。タンパク質のピクトグラムの中心の色は、これらのタンパク質をコードする遺伝子転写物のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションの程度を示します。タンパク質のピクトグラムの周囲の色は、(c) のバーの色に対応します。 c (a) および (b) に示すタンパク質をコードする転写物の FC。略語の定義は補足表 8 に示されています。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

対照的に、硝化細菌の一酸化窒素レダクターゼ（N2O形成、nor）をコードする遺伝子の転写物は、酸性化によって上方制御されました（図4a）。 AOBのnorB、norC、norD、およびnorQ遺伝子の発現は、それぞれ2.5、16.2、0.7、および0.2倍上方制御されました（図4cおよび補足表9）。これらの結果は、酸性化条件下で観察された N2O 放出の刺激の分子的証拠を提供します。シトクロム c554 (cycA によってコードされる)57、シトクロム c'-β (cytS によってコードされる)58、シトクロム P46036 などの代替酵素も細菌の N2O 放出の硝化に寄与した可能性がありますが、この研究ではこれらのタンパク質の転写物は観察されませんでした。。一酸化窒素レダクターゼ遺伝子の発現が劇的に上方制御されるのとは対照的に、硝化細菌の亜硝酸レダクターゼ (NO 形成、nirK) の転写物は、周囲対照と比較して酸性処理では 43% 下方制御されました (P < 0.05)。 (図4cおよび補足表9)、これは、硝化細菌によるNO2-還元が酸性化によって阻害された可能性があることを示唆しています。したがって、酸性化条件下での N2O 放出の増加は、細菌性硝化装置の脱窒経路に由来するものではありません。非生物的ハイブリッド反応が古細菌の N2O 生成の主な供給源であることが示唆されているが 32,37,38、銅ヒドロキシルアミン酸化還元酵素 (Cu-HAO) や推定ニトロキシル酸化還元酵素などの推定酵素が AOA の N2O 生成に関与していると推測されている 59。しかしながら、これらの推定上のタンパク質の転写物は観察されなかった（図５ａ）。さらに、古細菌の亜硝酸銅レダクターゼ（nirK）は、細菌のようなHAOとして機能してNH2OHをN2Oに酸化するか、硝化脱窒を介してAOAのN2O生成に関与している可能性があります59。それにもかかわらず、古細菌nirKの発現はわずかに下方制御されていたため、古細菌nirK遺伝子の転写応答は、酸性化下でのN2O放出増加の主な原因ではない可能性があります（図5c）。反対に、推定上の古細菌の一酸化窒素還元酵素norQ遺伝子の転写物は、酸性化条件下で0.2倍上方制御されました（図5c）。一方、AOA による N2O 生成経路の理解は限られているため、酸性化下での AOA を介した N2O 放出の増加の分子機構をさらに解明する必要があります。

シアノバクテリアの細胞内 pH は、酸性条件下では水の pH とともに低下することが報告されています 53。このケースが硝化剤で発生した場合、アデノシン三リン酸 (ATP) の合成に必要なプロトン推進力 (PMF) をさらに生成する必要がある可能性があります60。しかし、濃縮された硝化細菌のプロトン移動膜結合酵素に関与する遺伝子転写物は、酸性化処理において下方制御された（Log2FC < -1）（図4a）。複合体 I の NADH-キノン酸化還元酵素遺伝子 (nuo)、複合体 III のユビキノール - シトクロム c 還元酵素遺伝子 (pet)、複合体 IV のシトクロム c オキシダーゼ遺伝子の硝化細菌転写物は、60%、57%、および 61% ダウンレギュレートされました。酸性化条件下でそれぞれ%。(図4c)。したがって、これらのデータに基づいて、硝化細菌の細胞質 pH が強制的な酸性化の程度の下で低下したかどうかを区別することはできません。それにもかかわらず、エネルギーを産生するアデノシントリホスファターゼ (ATPase) をコードする遺伝子の転写物を詳しく調べると、重要な洞察が得られました。細菌の ATPase ファミリーは、膜貫通 PMF を使用した ATP 合成、または ATP 加水分解から放出されるエネルギーを使用した PMF の確立のいずれかを担う膜結合タンパク質複合体で構成されています 61,62。メタトランスクリプトームデータに基づいて、ATP依存性プロトンポンプとして機能する細菌のV型ATPアーゼをコードする遺伝子の転写物は、酸性化条件下で上方制御されました（最大11.5倍増加）（図4c）。この結果は、~0.3 pH 単位の低下下で pH 恒常性と H+ 勾配を維持するために細胞質プロトンをポンピングする硝化細菌の必要性が高まっていることを示唆しています。同様に、複合体 I の古細菌 nuo 遺伝子、複合体 IV のチトクロム C オキシダーゼ cox 遺伝子、および古細菌 V 型 ATPase atp 遺伝子の転写物は有意に上方制御され（Log2FC > 0.5; 図 5a）、 AOA は水の pH も低下した可能性があります。

酸性化条件下では、対応するATP結合カセットトランスポーターをコードする遺伝子転写物が上方制御されるため、膜を横切る基質の移動のためのエネルギー需要の増加が発生する可能性があります（最大11倍の上方制御、図4cおよび5c）。これらの結果は、NH3 または NO2- 酸化に由来するエネルギーの多くが、サイトゾルの pH 恒常性や基質輸送の維持など、酸性化ストレスに対処するために割り当てられていた可能性があることを示唆しています。しかし、酸性化によって硝化率が大幅に阻害されたため、ATP の総生産量はおそらく減少したと考えられます。さらに、PMF駆動ATPシンターゼとして機能する細菌のF型ATPアーゼをコードする遺伝子の転写物は、酸性化によって下方制御されました（平均63％の減少、図4c）。それにもかかわらず、カルボキシル化酵素であるリブロース二リン酸カルボキシラーゼオキシダーゼ（Rubisco）を飽和させる炭素濃縮機構に関連する遺伝子の発現は、酸性化条件下で下方制御され（Log2FC < -1;図4a）、エネルギー要件の低下を示唆しています。 CO2濃縮のため63（補足テキスト2）。この調節機構は、おそらくより多くのエネルギーが節約され、他の細胞プロセスに再割り当てされたため、高pCO2下ではあるが周囲のpHレベル（800μatm / pH 8.1）下で観察された「CO2受精」効果を説明できる可能性があります（図3a）。しかし、酸性化条件（800μatm / pH 7.8）では顕著なマイナスの効果が観察されたため、炭素源の上昇による節約されたエネルギーは、酸性化によって引き起こされる妨害と比較するとわずかであると思われます（図3a）。まとめると、これらの結果は、酸性化が ATP の産生低下と、このエネルギーの再配分を化学合成独立栄養性増殖の促進ではなく細胞維持のサポートに導く可能性があることを示唆しています。実際、優勢な硝化細菌の増殖率は酸性化処理で減少しました（ニトロソモナスとニトロスピラではそれぞれ約25％と27％の減少）（補足図16a、b）。 CO2 固定に関与する遺伝子転写物 [ニトロソモナスのカルビン回路およびニトロスピラの還元的トリカルボン酸回路] が遍在的に下方制御されていたため、さらなる証拠が転写レベルで観察されました (補足テキスト 3、図 4b、c)25,27。ただし、エネルギー的により有利なAOAの3-ヒドロキシプロピオネート/4-ヒドロキシブチレート炭素固定経路に関与する遺伝子転写物24,26は、一般に酸性化条件下で上方制御されました（図5b、c）。これらの結果と一致して、酸性化処理では比較的高いAOA存在量が検出されました（ P < 0.05）（補足図16c）。これは主にニトロソプミルス（優勢なAOA属）の化学独立栄養性増殖によるものであり、その相対存在量も酸性化条件下で増加しました（補足図16c）。 P < 0.05) (図 6a)。したがって、水の酸性化により、アンモニア酸化剤のコミュニティが変化し、AOB に対する AOA の比率が増加する可能性があります。この変動は、AOA の NH3 親和性が高いこと 22,64 と、酸性化条件下での NH3 利用可能性の低下によっても引き起こされる可能性があります 25。ただし、参考文献。 44 は、AOA 集合体の組成が海洋酸性化の影響を受けにくいと報告しました。これはおそらく、彼らの研究における潜伏期間 (1 週間未満) が集合体内で大幅な代謝回転を引き起こすほど長くなかったためと考えられます。

a 同じシーケンスライブラリー内の細菌と古細菌の両方を検出できるユニバーサルプライマーを使用した 16S rRNA 遺伝子シーケンスに基づく、硝化微生物の相対的な存在量。挿入されたプロットは、アンモニア酸化古細菌 (Nitrosopumilus および Nitrososphaera) の相対的な存在量を示しています。単一アスタリスクは P < 0.05 での有意差を示し、二重アスタリスクは P < 0.01 での有意差を示します。エラーバーはSD (n = 3の生物学的に独立したサンプル)を表し、点は反復の対応するデータポイントです。 b メタトランスクリプトーム配列データに基づく、comammox の主要な硝化遺伝子転写物の割合。ボックスチャートの水平線は中間を示し、星は平均を表します。ボックスは 25 パーセンタイルと 75 パーセンタイルを示し、ひげは 5 パーセンタイルから 95 パーセンタイルまでの範囲を示し、曲線は値の分布を示します。単一のアスタリスクは、P < 0.05 (n = 6 遺伝子) での有意差を示します。有意差は、一元配置分散分析 (ANOVA) によって決定されました。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

さらに、硝化細菌のコミュニティは酸性化の影響を受けました（図6a）。ニトロソモナス（主要な AOB）の相対存在量は酸性化処理で減少しました（P < 0.05）が、ニトロスピラ（コマンモックスを含む主要な亜硝酸酸化細菌（NOB））の相対存在量は増加しました（P < 0.05）。既知のアンモニア酸化剤に対するニトロスピラのこの全体的な増加した比率は、酸性化条件下でコマンモックスの比率が増加していることを示しています。実際、comammox amoA 遺伝子の存在量は酸性化処理の方が高かった（P < 0.05）（補足図16d）。さらに、メタトランスクリプトームデータに基づくと、周囲対照（わずか 0.03 ～ 0.89 %、P < 0.05）（図6bおよび補足図17）。興味深いことに、NH3からNO2-への酸化に関与する遺伝子転写物（amoおよびhao）の増加は、NO2-酸化（nxr）に関与する遺伝子転写物よりも高く（図6b）、コマンモックスの一部が機能するだけである可能性を示唆しています酸性化条件下では、完全ではなく部分的なアンモニア酸化剤として作用します。ただし、この仮説を検証するにはさらなる調査がまだ必要です。これらのデータは、水中の酸性化が河口および沿岸生態系における硝化群集とその生理学的代謝に重大な影響を与えていることを示しています。

結論として、我々の調査結果は、人間の活動によって誘発された富栄養化と大気中のCO2上昇の相乗効果により進行中の水質酸性化が、窒素循環の重要なつながりを破壊し、河口および沿岸水域における強力な温室効果ガスN2Oの生成を増加させる可能性があることを示唆している。我々の予想に反して、pCO2の上昇は、酸性化条件下で化学合成独立栄養性硝化因子に対して「CO2受精」効果を示さなかった。硝化剤は転写レベルで酸性化に大きく反応し、酸性化ストレスに対処するために細胞内 pH 恒常性に関連する遺伝子発現を大幅に上方制御します。これらの結果は、硝化とそれに伴うN2O排出に影響を与える酸性化の根底にあるメカニズムについて重要な洞察を提供し、河口および沿岸水域のさらなる酸性化が窒素循環を変化させ、N2O排出を刺激することによって地球温暖化を加速させる可能性があることを提案する。

長江は流量の点でヨーロッパ・アジア大陸最大の川であり、世界で 3 番目に長い川でもあります。長江流域は急速な経済発展と人口密度の高さが特徴です。集中的な人間の活動により、かなりの量の反応性窒素が長江河口と隣接する沿岸地域に放出され、深刻な窒素汚染と急速な水の酸性化につながっています65。したがって、水中の酸性化に対する硝化速度とそれに伴う N2O 放出の応答を調査するための研究地域として長江河口が選択されました。この目標を達成するために、河口口から隣接する沿岸地域までの河口勾配に沿って 6 つの代表的なサンプリングサイト (Yz1 から Yz6) が選択されました。

この研究では、通常、より活発な硝化とより深刻な酸性化を示す海底近くの海水が、2020年の中国国立自然科学財団の3月のクルーズ中にこれらの場所から、導電率の高い上に取り付けられたNiskin-Xボトルを使用して収集されました。 -温度深度（CTD）プロファイラー（Sea-Bird 911 plus）（図1）。水深、塩分、pH、DO は、CTD プロファイラー、pH メーター (Thermo Orion 3-Star)、および Winkler 法を使用して記録されました。各サイトからの水の一部は、その後の酸性化実験のために暗所で 4 °C で保存されました。一方、既知量のサブサンプルを孔径 0.22 μm の滅菌フィルター (Waterman) で直ちに濾過し、濾液は栄養素分析用に保存し、膜は後の DNA 抽出に備えて -20 °C で注意深く保存しました (補足方法)。サイト Yz3 からの余分な量のサブサンプルも、後の長期操作実験のために暗所で 4 °C で保存されました。

酸性化実験は、加湿され、0.22 μm で濾過された合成空気で水サンプルを連続的かつ穏やかにバブリングさせることにより、一連の連続フロー操作システム (スイス、Infors のバイオリアクターに基づいて構築、4.0 L の水サンプルと 1.0 L のヘッドスペースを使用して構築) で実施されました。 (79% N2 および 21% O2):CO2 混合物 (20 mL min-1、質量流量計によって正確に制御)。入口空気:CO2 の泡は、入口空気流 (~30 rpm) の底部と上方に設置された 2 つのスターラーによって水域内に穏やかに分散され、水系を均一にし、液相と気相を平衡させました。平衡後、気密シリンジを使用して反応器からヘッドスペースガスを収集し、N2O の天然同位体特徴を分析して、N2O 生成経路を明らかにしました（補足方法）。続いて、トレーサーとして 15NH4Cl (>98 原子パーセント 15N、周囲濃度の 20% 未満) を添加し、NOx- (NO3- + NO2-) プールでの 15N の蓄積によって硝化率を測定しました。速度測定中、NH3 酸化のプロセス中にプロトン (H+) が放出される可能性があるため、水の pH は反応器の酸塩基自動調整装置を介した 0.2 M NaOH 溶液によって安定に維持されました。一方、DO 濃度は飽和に維持され、pCO2 は 100 mL h-1 のガス流によって目標レベルに維持され、流出ガスはガスサンプリングバッグ (Teflon®FEP、DuPont) で収集されました。温度は、自動加熱プレートおよび冷循環水浴によって室温（25℃）に維持した。インキュベーション中、装備された pH センサー (スイス、ハミルトン)、DO センサー (スイス、ハミルトン)、温度センサー (スイス、Infors) を介して、pH、DO、および温度をそれぞれリアルタイムで記録しました。インキュベーションは、反応槽を不透明な紙で覆い、暗所で行った。液体サンプル (30 mL) を、24 時間のインキュベーションの開始時と終了時に、気密シリンジを使用して、予備のサンプリングチューブ (サンプリング後にしっかりと締め付けた) を通して収集し、すぐに濾過しました (0.22 μm、Waterman)。ろ過水の一部は NO3- および NO2- の測定に使用され、他の部分は「脱窒法」67 を使用した 15NOx- 分析用に調製されました。さらに、DIC、アルカリ度、および pCO2 の測定のために、別の 30 mL の水サンプルが収集されました。一方、ガスサンプルは、CO2、N2O、およびN2O同位体測定用の気密シリンジを使用して抽出されました。使用前に、試薬溶液は濾過滅菌（0.22μm、ウォーターマン社製）し、反応タンクおよび関連材料は加熱滅菌（121℃、15psiで20分間）した（以下同じ）。すべての実験は 3 回繰り返して行われました。硝化率は次の方程式を使用して計算されました68:

ここで、Rnitrification は硝化率 (nmol L−1 h−1)、\({R}_{t0}{{{NO}}_{X}}^{-}\) および \({R}_{ t}{{{NO}}_{X}}^{-}\) は、最初に測定された \({{{NO}}_{X}}^{-}\) プール内の 15N の比率です。それぞれインキュベーションの (t0) および最終 (t) 時間です。 \({\left[{{{NO}}_{X}}^{-}\right]}_{t0}\) と \({\left[{{{NO}}_{X}}^ {-}\right]}_{t}\) は、初期時間 (t0) と最終時間 (t) における \({{{NO}}_{X}}^{-}\) の濃度です。それぞれインキュベーション。 \({\left[{\!\,}^{14}{{{NH}}_{4}}^{+}\right]}\) と \([{\,\!}^{15 {{{NH}}_{4}}^{+}]\) は周囲の \({{{NH}}_{4}}^{+}\) 濃度と最終的な \({\, \!}^{15}{{{NH}}_{4}}^{+}\) 安定同位体トレーサー添加後の濃度。

N2O 生成率は、45 および 46 N2O (\({\,\!}^{45}N_{2}\) および \({\,\!}^{46}N_{2) の質量の増加に基づいて計算されました。 }\)) 実験中69:

ここで \({R}_{{N}_{2}O}\) は N2O 生成速度 (pmol N2O-N L−1 h−1) です。上述したように、F は基質 (\({{{NH}}_{4}}^{+}\)) プール内の 15N の割合です。 \({{\,\!}^{45}N_{2}}O_{t0}\) と \({{\,\!}^{45}N_{2}}O_{t}\) は次のことを示しますそれぞれ、培養の最初の時間 (t0) と最後の時間 (t) における \({\,\!}^{45}N_{2}O\) の量。 \({{\,\!}^{46}N_{2}}O_{t0}\) と \({{\,\!}^{46}N_{2}}O_{t}\) はそれぞれ、培養の最初の時間 (t0) と最後の時間 (t) における \({\,\!}^{46}N_{2}O\) の量。 V は水サンプルの体積 (L) を表します。

酸性化下での硝化速度および関連する N2O 生成に対する pCO2 の増加と pH の減少の潜在的な影響を区別するために、酸性化実験と同様に一連の連続気流操作システムを構築しました。簡単に言うと、シミュレーションシステムの 4 つのグループが構築されました: (a) 400 μatm/pH 8.1 (周囲対照グループ)、(b) 400 μatm/pH 7.8 (pH のみの低下、pCO2 を周囲レベルに維持)、(c) 800 μatm / pH 7.8（酸性化グループ）、（d）800 μatm / pH 8.1（pCO2のみの増加、pHを周囲レベルに維持）（補足図7）。サイト Yz3 から収集した水サンプル 4 L を反応器ごとに加え、15 NH4Cl (>98 原子パーセント 15N) を周囲の NH4+ 濃度の 20% 未満になるまで加えました。炭酸塩の化学的性質は、pHを調整しながら（bおよびcグループでは7.8、グループでは8.1）、0.22μmでろ過したCO2調整空気（グループaおよびbでは400μatm、グループcおよびdでは800μatm）で水サンプルを着実にバブリングすることによって操作されました。 a および d) 反応器の酸塩基自動調整器を介して滅菌酸 (0.1 M HCl) または塩基 (0.2 M NaOH) 溶液を使用します。他の反応条件（温度、DO、ガス流量、撹拌速度、暗条件）は酸性化実験と同じでした。平衡後の 24 時間のインキュベーション中に、硝化速度と N2O 生成速度を上記のように測定しました。すべての実験は 3 回繰り返して行われました。

別の 2 つのグループの操作システムは、長期酸性化実験のために、サイト Yz3 からの水サンプルを使用して同様に設定されました：（a）400 μatm/pH 8.1（対照グループ）および（b）800 μatm/pH 7.8（酸性化グループ）。水域の pCO2 と pH は、加湿され 0.22 μm でフィルター処理された周囲の空気 (400 μatm、グループ a) または CO2 富化空気 (800 μatm、グループ b) を連続的にバブリングすることによって操作され、pH はそれぞれ 7.8 または 8.1 で安定しました。。長期の酸性化実験中、NH4+が補充され、リアクター内でほぼ周囲濃度（10μM未満）に維持されました（補足図10）。 NH4+ の約半分が消費された後、適切な NH4+ 濃度を含む濾過滅菌現場水サンプルを培地として使用し、すべての反応器に 1 L day-1 の流量で供給しました。 0.2 M の滅菌 NaOH 溶液を使用して、硝化の過程で放出された H+ を中和しました。前述のように、DO を飽和に維持し、温度を 25 °C に維持しました。インキュベーション中、液体サンプル (10 ml) を毎日リアクターから収集し、NH4+、NO3-、および NO2- の測定のために直ちに濾過 (0.22 μm、Waterman) しました。 N2O と CO2 の分析用に、気密シリンジを使用してヘッドスペースガス 2 ml を毎日収集しました。既知量のサンプルを数日ごとに収集し、遠心分離 (20,000 g、5 分) によってペレット化しました。ペレットは、DNA 抽出、その後のパイロシーケンスおよび qPCR アッセイにすぐに使用されました (補足方法、補足表 10)。硝化速度と N2O 生成速度を測定するために、サブサンプルも毎週収集されました。 1 か月のインキュベーションの終わりにサンプルを収集し、ペレット化し (20,000 g、5 分間、2 °C で)、その後のメタトランスクリプトーム分析のために直ちに液体窒素中で凍結保存しました。

AOA濃縮のために、作業量4.0Lの連続フロー硝化バイオリアクター(Infors、スイス)を、サイトYz3からの淡水サンプルを用いてセットアップした。 NH4+ (約 10 μM) とストレプトマイシン (約 50 mg/L、硝化細菌を阻害するため 70,71) を添加したフィルター滅菌済みの現場水を、1 日あたり約 0.5 L の流量で継続的に供給しました。空気を連続的に流すことにより、DO 濃度を飽和に維持した。反応器の酸塩基自動調整器を介して０．２ＭＫＨＣＯ３溶液を用いてｐＨを８．１に維持した。インキュベーションは暗所で行い、上記のように温度を25℃に維持した。インキュベーション中、液体サンプルをリアクターから収集し、NH4+、NO3-、および NO2- の測定のために孔径 0.22 μm フィルター (Waterman) を使用して直ちに濾過しました。さらに、DNA 抽出とその後のパイロシーケンスのためにサンプルを収集し (20,000 g、5 分)、AOA の濃縮をモニタリングしました (補足方法)。 50 日間のインキュベーション後、AOA 濃縮培養物を収集して、硝化速度と N2O 放出速度を測定しました。

反応器から収集した液体サンプルを遠心分離（6,000 g、5 分間）して、硝化が豊富なバイオマスを収集しました 27。次に、遠心分離管の底にある沈殿したバイオマスを、濾過滅菌現場水を使用して３回洗浄し、速度測定前にその中に再懸濁した。続いて、この懸濁液 100 μl を気密ガラスバイアル (120 ml) に移し、その中で NH4+ (最終濃度約 10 μM) を含む新鮮なフィルター滅菌部位水 10 ml を CO2 調整空気 (400 μatm または800μatm）。インキュベーション中、3-(N-モルホリノ) プロパンスルホン酸 (MOPS、pH 8.1 または 7.8 に調整、最終濃度 20 mM) を添加することで、pH を目標レベルに維持しました 23。バイアルを暗所、オービタルシェーカー (30 rpm) 上で 25 °C でインキュベートしました。各サンプリング間隔 (0、5、8、12、および 24 時間) で、3 つの複製を犠牲にし、2 ml のヘッドスペースガスを CO2 および N2O 分析用に抽出しました。目標の pH と DO は、それぞれ Mettler-Toledo pH Meter と酸素針センサー (Unisense) を備えた OXY Meter S/N 4164 を使用して確認しました。一方、NOx - 測定のために、各バイアル中の懸濁液 5 ml を直ちに濾過しました (0.22 μm、Waterman)。硝化率は、時間の経過に伴う NOx- 濃度の線形変化に基づいて推定されました 23。硝化活性の阻害は、周囲対照と比較した酸性処理における硝化速度の減少率として表されました。 N2O 放出に対する酸性化の影響は、周囲制御と比較した酸性化処理における N2O 濃度 (ガラスバイアルのヘッドスペース内) の変化率に基づいて決定されました 23。

インキュベーションの最後に、EZNA® Soil RNA キット (Omega Bio-tek、ノークロス、ジョージア州、米国) を使用して、三重の周囲対照 (400 μatm/pH 8.1) および酸性化処理 (800 μatm/pH 7.8) から全 RNA を抽出しました。残留ゲノム DNA を Turbo DNA-free キット (Ambion) で除去し、プライマー 515F (5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3') および 909R (5'-CCCCGYCAATTCMTTT RAGT-3') を使用した PCR によってさらに検証し、DNA 汚染を除外しました 23。抽出された RNA の純度、完全性、および濃度は、Agilent2100 (Agilent) および Nanodrop2000 (Thermo) を使用して測定されました。次に、Ribo-Zero rRNA Removal Kit (Epicentre) を介してリボソーム RNA (rRNA) を除去し、適格な mRNA を取得し、qPCR 分析 (補足メソッド) およびメタトランスクリプトームシーケンスに使用しました。

メタトランスクリプトーム cDNA ライブラリーは、TruSeq RNA サンプル調製キット (Illumina) を使用して構築され、周囲対照および酸性化処理からの 3 つの mRNA サンプルを個別にプールした後、Illumina HiSeq4000 プラットフォームで配列決定されました 72。生のリードの品質は FastQC によってチェックされ、SeqPrep (https://github.com/jstjohn/SeqPrep) によってトリミングされました。その後、Sickle (https://github.com/najoshi/sickle) を使用して生のリードを品質フィルター処理し、あいまいな (N) 塩基、低品質 (20 未満)、および 50 塩基対 (bp) 未満の長さを含む配列を抽出しました。廃棄されました。 SortMeRNA (http://bioinfo.lifl.fr/RNA/sortmerna/) をさらに使用して、rRNA リードをスクリーニングして除去しました。得られた高品質の mRNA クリーンリードは、Trinity de novo アセンブリパイプラインを使用して組み立てられました (200 bp 未満のコンティグは削除されました)73。 MetaGeneMark (http://exon.gatech.edu/meta_gmhmmp.cgi) を使用してオープンリーディングフレーム (ORF) を予測し、100 bp を超えるものはアミノ酸配列に翻訳されました。非重複コンティグ (95% の同一性、90% のカバレッジ) は、CD-HIT ソフトウェア (http://www.bioinformatics.org/cd-hit/) を介して取得されました。転写物の発現レベルは、kallisto (https://pachterlab.github.io/kallisto/) を介して計算され、TPM (Transcripts Per Kilobase Million) として報告されました。相対的な遺伝子発現の変化倍数 (FC) は、酸性化処理を周囲対照と比較することによって計算されました。転写産物の分類学的所属は、ビニングを介して NR データベースの最良のヒットに割り当てられました (BLASTP、e 値 ≤ 10−5)。潜在的な機能は、KEGG (京都遺伝子およびゲノム百科事典) データベース内のタンパク質に対する最良の相同性に基づいて割り当てられました (BLASTP、e 値 ≤ 10−5)。最尤ツリーは、1000 個の超高速ブートストラップを備えた IQ-TREE74 で構築され、iTOL (インタラクティブツリーオブライフ)75 によって視覚化され、注釈が付けられました。

CO2 および N2O の濃度はガスクロマトグラフィー (GC-2014、島津製作所、京都、日本) によってモニタリングされました。 N2O 同位体比 (m/z = 44、45、46) は、同位体比質量分析法 (IRMS、Delta V Advantage、Thermo Fisher Scientific、ブレーメン、ドイツ) で分析されました。 N2O 生成経路を明らかにするための天然 N2O 同位体特徴 (δ15Nbulk、δ15Nα、およびδ18O) を IRMS (Delta V Plus、Thermo Fisher Scientific、ブレーメン、ドイツ) で分析しました。 NH4+、NO3-、および NO2- の濃度は、連続フロー栄養素分析装置 (Skalar SANplus、Skalar Analytical BV、Breda、オランダ) を使用して比色定量的に測定しました。検出限界は、NH4+-N については 0.3 μM、NO2--N については 0.05 μM でした。およびNO3--N。 DIC 濃度は、酸性化とその後の放出 CO2 の定量によって分析されました (炭素電量計、UIC-INC、アメリカ)。アルカリ度および pCO2 は、参考文献の炭酸解離定数を使用した pH および DIC 測定に基づいて、CO2SYS プログラム 76 によって計算されました。参照により異なる機能形式に再装備された 77。 78.

統計分析は、Windows 用 SPSS バージョン 19.0 (SPSS Inc.、米国イリノイ州シカゴ) を使用して実行されました。異なる治療を受けたグループ間の有意差は、一元配置分散分析 (ANOVA) とそれに続く Tukey の正直検定によって特定されました。非線形近似曲線 (多項式近似) は、Origin 2022b を使用して構築され、さまざまなレベルの酸性化に対する硝化および関連する N2O 生成速度の応答を調査しました。 P < 0.05 の場合、結果は有意であると見なされます。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

すべての配列データとサンプル情報は、国立バイオテクノロジー情報センター (NCBI) の配列読み取りアーカイブ (SRA) データベースで BioProject アクセッション番号 PRJNA876082 として入手できます。論文の結論を評価するために必要なすべてのデータは、論文および/または補足資料に記載されています。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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この研究は、中国国家自然科学財団 (番号 41725002 [LJH]、41971105 [YLZ]、42222605 [YLZ]、42030411 [LJH]、42249903 [LJH]、41671463 [LJH]、および 41730646 [ML]) によって支援されています。）、中国国家基礎研究開発重点プログラム（番号 2016YFA0600904）[LJH]、華東師範大学地理情報科学重点研究所所長基金（教育省）（補助金番号 KLGIS2022C03）[YLZ] 。サンプルは、長江河口へのオープンリサーチクルーズ（NORC2020-03およびNORC2023-302）中に収集されました。原稿に関する議論と修正をしていただいた WS Gardner 氏と Silvia E. Newell 氏に感謝します。

Jie Zhou 氏、Yanling Zheng 氏も同様に貢献しました。

河口および沿岸研究の国家重点研究所、長江デルタ河口湿地生態系観察および研究ステーション、華東師範大学、上海、200241、中国

Jie Zhou、Yanling Zheng、Lijun Hou、Zhirui An、Feiyang Chen、Bolin Liu、Hongpo Dong、Xia Liang、Xiaofei Li、Dengzhou Gao

華東師範大学地理科学院、上海、200241、中国

Yanling Zheng、Li Wu、Lin Qi、Ping Han、Guoyu ying、Yi Yang、Ye Li、Min Liu

地理情報科学重点実験室（教育省）、華東師範大学、上海、200241、中国

Yanling Zheng、Li Wu、Lin Qi、Ping Han、Guoyu ying、Yi Yang、Ye Li、Min Liu

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Yanling Zheng、Ping Han、Guoyu ying、Yi Yang、Ye Li、Min Liu

テキサス大学オースティン海洋科学研究所、ポートアランサス、テキサス州、78373、米国

リウ・ザンフェイ

ノルウェー水研究所、Thormøhlensgt 53D、5006、ベルゲン、ノルウェー

リチャード・ベラービー

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YLZ、LJH、ML がこの研究を発案しました。 JZ、YLZ、LJH、ZRA、FYC、BLL、LW、LQ が調査を実施しました。 JZ、YLZ、LJH、HPD、PH、GYY、XL、YY、XFL、DZG、YL、ZFL、RB、ML がデータを分析しました。 JZ、YLZ、LJH、RB、ML がこの論文を執筆しました。

Yanling Zheng、Lijun Hou、または Min Liu との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Yong-guan Zhu と他の匿名の査読者に感謝します。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Zhou、J.、Zheng、Y.、Hou、L. 他。河口および沿岸水域における硝化およびそれに伴う亜酸化窒素排出に対する酸性化の影響。 Nat Commun 14、1380 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-37104-9

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受信日: 2022 年 9 月 16 日

受理日: 2023 年 2 月 28 日

公開日: 2023 年 3 月 13 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37104-9

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河口および沿岸水域における硝化およびそれに伴う亜酸化窒素排出に対する酸性化の影響